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以gp120为靶点的HIV进入抑制剂的合成及筛选研究

作　者: 王玉芹
导　师: 刘叔文
学　校: 南方医科大学
专　业: 药理学
关键词: 艾滋病 HIV gp120 作用机制 HIV 进入抑制剂 Arg61
分类号: R943
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景和目的艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)感染引起的疾病,严重威胁人类的生存,对人口健康和社会经济的发展产生巨大的影响,全世界估计有3400万人感染艾滋病。艾滋病病毒的基因组比已知任何一种病毒基因都复杂,而且变化多样。到目前为止,依然没有一种疫苗可以付诸大规模使用。在今后相当长的一段时期内,发展安全有效的抗艾滋病药物,依然是当前艾滋病预防和治疗的重点。迄今为止已有24种化合物实体和至少9种组合物被批准用于临床。可分为逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂和病毒进入抑制剂四大类。前两类药物易诱导HIV耐药性突变,而且对人体有较大的毒副作用,后两类仅有3种化合物实体被批准。HIV进入抑制剂,尽管目前仅有Enfuvitide (T-20)和Maraviroc两种,但它们对耐受前两类抗HIV药物的病毒依然有效。并且,进入抑制剂是作用在HIV感染的早期阶段,能够阻止HIV与靶细胞的融合,被认为在艾滋病的防治上具有更好的应用前景。开发新的阻止病毒进入的抗HIV药物也成为目前抗艾滋病药物研究的热点。HIV进入靶细胞的过程主要由包膜蛋白(Envelope Proteins, Env)介导。在HIV进入靶细胞过程中,首先是gp120与靶细胞上的CD4分子和辅助受体(趋化因子受体CCR5或CXCR4等)先后结合,随后跨膜亚基gp41的构型发生改变,介导病毒包膜与靶细胞膜的融合,完成病毒进入宿主细胞的感染过程。从病毒融合机制的角度,HIV进入抑制剂可分为三大类,一是干扰gp120与CD4受体结合；二是拮抗辅助受体,阻止其与gp120-CD4复合物结合；第三类是阻止gp41核心结构的形成,称为HIV融合抑制剂。目前,针对HIV进入抑制剂的研究主要集中在两个方面：一是针对gp120为作用靶点,因为HIV gp120与靶细胞上的CD4受体相结合是病毒进入靶细胞的第一步,如果能在病毒感染的第一步就进行抑制,理论上则可对人体的危害性降到最低,有更好的应用前景；二是针对gp41六螺旋束核心骨架的形成进行抑制。作用于HIV gp120的进入抑制剂主要为大分子的抑制剂和小分子的抑制剂两大类。其中,大分子抑制剂主要为可溶性CD4及其衍生物以及靶向gp120的广谱中和抗体两大类；小分子的抑制剂主要以抑制gp120与CD4结合为靶点,或者以Phe43结合空腔为靶点。其化学结构主要为BMS-378806、BMS-488043和NBD-556、NBD-557及其类似物。Zhou T等人从HIV感染者的血清中分离出两个抗体,VRC01和VRC02,它们能够抑制200多各种亚型HIV毒株中的90%,这是迄今为止分离得到的最广谱、最有效的中和抗体。通过VRC01-gp120共结晶的单晶x-射线衍射结构分析,VRC01的结构与CD4有一定的相似性,能部分地模拟CD4与gp120的结合。与CD4不同的是,VRC01在CD4与gp120结合方向上偏转了43°，并且离开了6A的距离。这使得VRC01既能结合于gp120上易受攻击的CD4作用位点,又能克服gp120表面糖基及构象的掩盖作用。VRC01上CDR H2的Arg61能插入到gp120上V5与p24围成的空腔中,并形成5个氢键的作用。Arg61结合靶穴可能是中和抗体具有广谱、高效活性的重要作用靶点。如果化合物能结合在这一结合靶点,则可能具有较好地抗HIV感染的活性。这项研究为抑制HIV的感染找到了座标,使得研制艾滋病疫苗的目标更加明确；同时,也为设计作用于gp120的小分子化合物找到了新的作用靶点,目前还未见报道作用于此靶点的小分子化合物。小分子进入抑制剂研究方面：BMS-378806与BMS-488043结合在gp120上的CD4结合位点,从而阻止gp120与CD4的结合,其IC50为5nmol/L。 BMS-378806进入了Ⅰ期临床试验研究,但因其抗病毒谱太窄被中止了进一步的临床研究。BMS-488043进入了Ⅱ期临床研究,但因为剂量相对太大(1800mg)而被暂停。针对BMS-378806所做的类似物的结构改造工作并没有取得很大的突破,目前还没有药物上市。NBD-556、NBD-557是本课题组大规模筛选33000个化合物的基础上得到的两个小分子化合物,化学结构为N-苯基N’-哌啶基草酰胺衍生物。作用机制研究表明,NBD-556能抑制gp120与CD4的结合,并且是特异性地作用于gp120,而不是受体CD4分子。NBD-556能起到类似可溶性CD4的作用,结合到gp120上的CD4Phe43结合口袋位置,诱导gp120发生构象变化,使gp120形成辅助受体结合位点。NBD-556活性在μM级,如何进行结构改造,提高其抗HIV活性,以及对各种亚型HIV病毒株的广谱抑制活性,是这类小分子化合物研究的关键。基于以上文献报道,我们拟从以下两方面进行研究：一、基于Arg61结合靶穴的化合物库虚拟筛选,并对虚拟筛选打分较高的化合物进行病毒活性测试。对活性化合物进行作用机制研究,并对活性化合物进行结构修饰,以期得到活性更好的化合物。二、基于Phe43结合靶穴的化合物结构改造及活性筛选。主要是以NBD-556为先导物,对其进行结构分析,并设计合成系列类似物,对合成的类似物进行抗HIV活性测试。总结其构效关系,以期发现广谱、高效的小分子化合物。方法对文献报道的gp120-VRC01复合物的单晶结构进行分析。VRC01的广谱中和活性与其CDR H2的Arg61能插入到gp120上V5与β24序列围成的空腔(Arg61靶穴)有关,我们首先在曙光W580I桌面超级计算机上,采用分子动力学模拟,运用MM-PBSA方法计算gp120与Arg61(位点1)以及VRC01的58-61序列(位点2)的结合自由能。利用分子对接方法,从库容为40000的IBS天然产物数据库中虚拟筛选能与gp120上的位点1和位点2结合的化合物,并进一步计算gp120与这些化合物的结合自由能变化。对结合自由能降低较大的化合物进行抗HIV假病毒及真病毒的活性筛选,确定先导化合物。最终筛选得到化合物NC-2,并对其抑制病毒感染活性的机制进行研究。同时以NC-2为先导物,对其进行结构修饰,合成系列类似物,并进行活性筛选。(1)配体数据库：ibs2009oct_nc:受体：3NGB-A；位点1Arg61,位点258到61号氨基酸序列。(2)用Surflex-Dock中基于配体的方法生成Protomol文件,利用分子对接技术,对ibs2009oct_nc天然产物库进行虚拟筛选,得到同时与两个位点结合打分较高的化合物。(3)计算打分较高的化合物与gp120结合的自由能变化情况,使用MM/PBSA的方法进行计算。并与△Ggp120-VRC01和△Ggp120-CD4进行比较。(4)对结合自由能变化较大的化合物购买,并测试其抗HIV病毒感染的活性,得到小分子NC-2候选化合物。(5)由于化合物NC-2有较好的抑制HIV假病毒与HIV-1mB实验株活性,所以对其作用机制进行研究。通过细胞-细胞融合实验,病毒-细胞融合实验,时间-过程实验,判断NC-2是作用于HIV的进入阶段；通过抑制gp120与CD4的结合实验,抑制gp41六螺旋束形成实验,研究其抑制HIV进入的作用靶点。(6)以NC-2为先导物,进行结构改造,设计合成系列化合物,并进行化学合成及抗HIV活性测试。目前文献报道的NBD-556类似物的改造,其活性并没有明显提高。对NBD-556化学结构进行分析,2,2,6,6-四甲基-哌啶基及中间的草酰胺连接骨架与其活性密切相关。因此,我们拟保留四甲基哌啶基,以及中间的草酰胺连接骨架,对其R取代基进行结构修饰,连接不同取代基的芳香环及杂环,并对合成的化合物抑制HIV感染的活性进行研究。(1)以草酰二乙酯或草酰氯单乙酯为原料,通过酯的胺解反应及取代反应,合成系列NBD-556类似物。(2)对合成的化合物,进行抗HIV活性测试。结果以Arg61结合靶穴为靶点进行虚拟筛选：分别以Arg61,58到61号氨基酸序列作为两个位点,对库容为40000的ibs2009oct_nc天然产物数据库进行筛选。先使用Surflex-Dock中基于配体的方法生成Protomol文件,使用12个CPU并行计算,其它参数使用默认值。对接得到位点1得分大于8.0的化合物113个,位点2得分大于8.0的化合物180个,其中有30个化合物既能与gp120上的位点1结合,也能与位点2结合,选取这30个化合物,进行结合自由能的计算。体系中的结合自由能的计算采用MM/PBSA与MM/GBSA的方法,分别计算了候选的30个化合物与gp120结合后的自由能差,并与△Ggp120-VRC01和△Ggp120-CD4相比较。gp120与Arg61(位点1)结合自由能的变化为：PBTOT=-10.67,GBTOT=-13.89.gp120与58-61序列(位点2)的结合自由能,PBTOT=-18.37,GBTOT=-16.27。其中,gp120与58-61序列的结合自由能降低值要大于gp120与Arg61结合自由能的降低值,说明58-61序列与gp120的结合能力要强于单一的氨基酸残基Arg61与gp120的结合能力。gp120与CD4的结合自由能,PBTOT=-57.95,GBTOT=-23.77.gp120与VRC01的结合自由能,PBTOT=-113.62,GBTOT=-78.88。通过计算可知,△Ggp120-VRC01小于△Ggp120-CD4,说明gp120与抗体VRC01的结合作用要强于gp120与CD4受体的结合,这个计算结果也能说明为什么VRC01结构与CD4类似,却具有更强效的中和能力,能阻止gp120与CD4结合。对侯选化合物与gp120结合自由能变化较大的19个化合物购买,并用假病毒体系进行抗HIV感染活性筛选。其中NC-2与NC-12有较好的抑制活性,并且这两个化合物与gp120结合自由能变化值也较大。NC-2抗HIV-1JRFL假病毒的IC50为10.58μM,抗HIV-1实验株HIV-1IIIB的IC50为1.95μM。而且NC-2对靶细胞的毒性较小,其对U87.CD4.CCR5细胞的CC50为121.25μM,对MT-2细胞的CC50为17.23μM。NC-12虽然也具有一定的抗病毒感染的活性,但其抑制病毒感染IC50和对靶细胞毒性CC50接近,因此NC-12对细胞毒性较大。其抗病毒活性可能是由于细胞毒性引起的。对NC-2抑制HIV感染的作用机制进行研究。NC-2能抑制细胞-细胞融合,以及病毒-细胞融合,时间-过程实验进一步确认NC-2作用于HIV感染的进入阶段,且作用于HIV的包膜蛋白(统计学采用2因素析因分析方法,P<0.001)。NC-2体外能抗gp120与CD4的结合,不能抑制gp41六螺旋束的形成(统计学采用单因素方差分析,多重比较LSD方法,P<0.001)。说明NC-2可能是通过抑制HIV gp120与CD4的结合,从而具有抑制HIV感染的作用。NC-2是天然产物中分离得到的,其来源有限,且活性在μμM级。需要对其进行结构优化,以期得到活性更好的小分子进入抑制剂。对NC-2化学结构进行分析,设计了两类化合物,并进行化学合成。其中,合成了2-(3,4,5-三甲氧基)苯甲酰基-5-(苯乙炔基)噻吩类似物9个。对其进行抗HIV假病毒活性测试,发现化合物7b和7c有抑制HIV-1JRFL假病毒感染的活性,其IC50分别为：21.36±0.78μM和15.14±6.27μM。以草酸二乙酯或草酰氯单乙酯为原料,通过酯的胺解反应及取代反应,合成系列NBD-556类似物8个。对其抗HIV活性进行测试,发现经结构改造后的化合物部分具有抗HIV假病毒感染的活性,但与NBD-556相比,活性没有明显提高。结论以Arg61结合靶穴为靶点,通过计算机虚拟筛选辅助病毒活性测试的方法,得到小分子化合物NC-2具有较好的抗HIV假病毒与HIV-1ⅢB病毒的活性。经作用机制研究,发现NC-2是作用于HIV感染的进入阶段,且作用靶点为HIV包膜蛋白。进一步的机制研究表明,NC-2体外能抗gp120与CD4的结合,不能抑制gp41六螺旋束的形成。这与我们虚拟筛选的目的一致,说明Arg61结合靶穴是小分子化合物抗HIV感染的一个重要作用靶点。此筛选模型有一定的可信度,有可能用于其它化合物库的大规模虚拟筛选。以NC-2为先导物,进行结构改造,己合成了2-(3,4,5-三甲氧基)苯甲酰基-5-(苯乙炔基)噻吩类似物9个。活性测试结果表明,化合物7b和7c有抑制HIV-1JRFL假病毒感染的活性,其IC50分别为：21.36±0.78μM和15.14±6.27μM。另一个系列的化合物的合成也已取得了突破性的进展。对其进一步的结构优化及构效关系研究,有可能得到活性更好的小分子化合物。以NBD-556为先导物,进行结构优化,合成了NBD-556系列类似物8个,抗HIV假病毒感染的活性表明,结构改造后,化合物的活性没有明显提高。

全文目录

摘要  3-10
ABSTRACT  10-20
前言  20-44
第一部分化合物库虚拟筛选及活性化合物作用机制、结构优化研究  44-96
  第一章化合物虚拟筛选及候选化合物活性检测  44-61
    一、材料与仪器  44-46
    二、实验方法  46-52
    三、实验结果  52-60
    四、小结  60-61
  第二章 NC-2抗HIV感染靶细胞的作用机制研究  61-80
    一、材料与仪器  61-63
    二、实验方法  63-69
    三、实验结果  69-79
    四、结论  79-80
  第三章 NC-2类似物的合成及活性筛选  80-96
    一、材料与仪器  80-82
    二、实验方法  82-85
    三、实验结果  85-91
    四、化合物结构确认  91-95
    五、小结  95-96
第二部分 NBD-556类似物的合成及活性筛选  96-106
  第一章 NBD-556类似物的合成  96-101
    一、材料与仪器  96-97
    二、实验结果  97-99
    三、实验方法  99-100
    四、小结  100-101
  第二章 NBD-556类似物抗HIV活性研究  101-106
    一、材料与仪器  101-102
    二、实验方法  102-103
    三、实验结果  103-105
    四、结论  105-106
讨论  106-113
结论  113-115
参考文献  115-123
附录  123-134
中英文缩写词  134-135
发表论文情况  135-136
致谢  136-138
统计学审稿证明  138

以gp120为靶点的HIV进入抑制剂的合成及筛选研究

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