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基于工具酶扩增和纳米金比色构建DNA信号放大新方法的研究

作　者: 王文硕
导　师: 马翠萍
学　校: 青岛科技大学
专　业: 有机化学
关键词: 信号放大 DNA纳米技术恒温扩增杂交链式反应纳米金比色检测
分类号: O657.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

DNA在生物传感器和功能纳米材料的构建中有着广泛的应用。DNA信号放大常用于构建高灵敏性的分析技术,尤其应用于痕量分析物的检测。具有特殊性质或结构的金属纳米材料也经常与DNA联用,进行新型传感器的设计或功能化纳米材料的开发,例如,具有特殊光学性质的纳米金就已广泛应用于生物传感器的设计。DNA技术由于可以实现多种形式的信号放大而在分析化学领域发挥着重要的作用。传统的DNA信号放大的方式,如聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR),依赖于热变性、工具酶和必要的仪器才能实现对目标的扩增,很难满足于发展快速、简便、易操作、便于观察的分析技术。因此,研究新型、恒温以及无酶参与的DNA信号放大方法具有非常重要的意义。本论文中,我们基于工具酶扩增和纳米金比色构建了两种DNA信号放大的新方法。一,我们将聚合酶和切刻酶联用,设计了一种核酸恒温扩增的新方法并用于miRNA的检测。在目标miRNA的含量为10-16-10-13mol范围内,检测结果具有良好的线性；通过对不同碱基序列的miRNA进行检测,验证了这种方法具有良好的特异性；通过对血清中样品的检测,检验了这种方法的实用性。二,我们将DNA修饰的纳米金与杂交链式反应(Hybridization Chain Reaction, HCR)相结合,构建了一种无酶参与的DNA信号放大的新型比色方法。这种方法简单,灵敏度高,不需要酶参与,利用这种方法进行目标的比色分析,仅用肉眼就可以检测到0.5nM的目标DNA。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
第一章前言  9-30
  1.1 DNA工具酶信号放大技术  9-14
    1.1.1 聚合酶链式反应  9-11
    1.1.2 DNA恒温信号放大  11-14
  1.2 动态DNA纳米技术  14-20
    1.2.1 DNA纳米机器  15-17
    1.2.2 DNA链置换反应  17-20
      1.2.2.1 DNA杂交链式反应  17
      1.2.2.2 发卡型DNA催化组装反应  17-18
      1.2.2.3 熵驱动DNA反应  18-19
      1.2.2.4 DNA“跷跷板”反应  19-20
    1.2.3 DNA纳米技术的应用  20
  1.3 纳米金比色分析技术  20-28
    1.3.1 纳米金的比色性质  20
    1.3.2 DNA修饰纳米金  20-22
    1.3.3 纳米金比色  22-27
      1.3.3.1 电荷中和引起的纳米金聚集  23-25
      1.3.3.2 DNA连接引起的纳米金聚集  25-26
      1.3.3.3 纳米金聚集体的分散  26-27
    1.3.4 荧光分析、电化学检测与表面增强拉曼散射  27
    1.3.5 纳米金的应用  27-28
  1.4 本论文的研究意义与主要内容  28-30
第二章工具酶恒温扩增检测miRNA的新方法研究  30-41
  2.1 引言  30-31
  2.2 实验部分  31-33
    2.2.1 仪器与试剂  31
    2.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳  31-33
      2.2.2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理  31-32
      2.2.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳的制备  32-33
    2.2.3 实时荧光检测  33
  2.3 结果与讨论  33-40
    2.3.1 实验原理  33-34
    2.3.2 DNA序列的设计  34-35
    2.3.3 电泳表征扩增结果  35
    2.3.4 酶的用量的优化  35-36
    2.3.5 实时荧光检测的原理  36-37
    2.3.6 灵敏度检测  37-38
    2.3.7 特异性检测  38-39
    2.3.8 溶解曲线  39
    2.3.9 血清中检测  39-40
  2.4 小结  40-41
第三章纳米金的合成与修饰  41-48
  3.1 引言  41
  3.2 实验部分  41-47
    3.2.1 仪器  41-42
    3.2.2 试剂  42
    3.2.3 纳米金的合成与表征  42-44
      3.2.3.1 纳米金的合成  42-43
      3.2.3.2 纳米金的表征  43-44
    3.2.4 纳米金浓度的计算  44
    3.2.5 DNA修饰纳米金  44-47
      3.2.5.1 纳米金表面修饰的DNA数量  44-45
      3.2.5.2 DNA修饰纳米金的过程  45-46
      3.2.5.3 茎环DNA修饰纳米金  46-47
    3.2.6 DNA修饰的纳米金的稳定性  47
  3.3 小结  47-48
第四章基于纳米金和杂交链式反应比色检测DNA新方法的构建  48-64
  4.1 引言  48-49
  4.2 实验部分  49-52
    4.2.1 仪器与试剂  49-50
      4.2.1.1 仪器  49
      4.2.1.2 试剂  49-50
    4.2.2 琼脂糖凝胶电泳  50-51
      4.2.2.1 基本原理  50
      4.2.2.2 浓度选择依据  50-51
      4.2.2.3 制备过程  51
      4.2.2.4 电泳表征HCR反应产物  51
    4.2.3 纳米金的合成与修饰  51
    4.2.4 未信号放大的比色检测  51-52
    4.2.5 HCR信号放大的比色检测  52
    4.2.6 特异性检测  52
  4.3 结果与讨论  52-63
    4.3.1 实验原理  52-53
    4.3.2 DNA链的设计  53-56
    4.3.3 琼脂糖电泳表征  56-57
    4.3.4 实验条件的优化  57-60
      4.3.4.1 HCR反应时间的优化  57-58
      4.3.4.2 H1和H2用量的优化  58-59
      4.3.4.3 不同反应方式下的比色检测  59-60
    4.3.5 比色检测结果图  60-63
      4.3.5.1 未信号放大的比色检测  60
      4.3.5.2 信号放大的比色检测  60-61
      4.3.5.3 比色检测的浓度-紫外可见吸收曲线  61-63
    4.3.6 特异性检测结果图  63
  4.4 小结  63-64
结论  64-66
参考文献  66-73
附录  73-74
致谢  74-75
攻读硕士学位期间发表的论文目录  75-76

基于工具酶扩增和纳米金比色构建DNA信号放大新方法的研究

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