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C_2H_2型锌指蛋白--ZNFD的生物学功能初探

作　者: 雷陈
导　师: 王明华；吴士良
学　校: 苏州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: ZNFD C2H2型锌指蛋白 AP1(PMA) 转录激活
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

C2H2型锌指基因是高等动物基因组中最大且最复杂的基因超家族,在人与小鼠基因组中拥有数百个成员。本实验室使用生物信息学分析,并结合NCBI数据库筛选得到一人源锌指基因ZNFD,基因号为NM₁82761,对ZNFD基因进行生物信息学方法分析,结果表明ZNFD为C2H2型锌指蛋白的一员,该锌指基因尚未见相关研究,故本实验室对该基因展开了以下几个方面的初步研究。首先,通过RT-PCR的方法从睾丸组织cDNA中克隆获得ZNFD基因,经测序鉴定ZNFD基因序列的正确性。利用生物信息学方法对ZNFD基因和蛋白进行分析,表明ZNFD基因位于第5号染色体,定位在5q23.1。ZNFD cDNA由5个外显子和4个内含子组成,含有990bp的开放阅读框,编码一个由329个氨基酸组成,分子量为37kDa的蛋白。对ZNFD基因进行组织表达谱分析证实ZNFD基因在前列腺、睾丸、脑、胰、子宫中表达,且睾丸和脑组织中表达量较高。通过生物信息学软件CLUSTAL W分析7种物种的ZNFD基因的同源性,分析表明目的蛋白的17-260aa有较高的保守性。通过构建真核表达重组质粒pEGFP-C1 -ZNFD,细胞亚定位分析结果显示ZNFD蛋白定位于细胞核。同时为了鉴定ZNFD蛋白的N端氨基酸序列与锌指模序对ZNFD蛋白细胞核定位的影响,分别构建了一系列截短型ZNFD与绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-C1）的重组质粒,转染Hela细胞进行细胞亚定位分析,证明了ZNF结构域对于ZNFD蛋白的核定位不是必须的。大量研究证明ZNF蛋白多为转录因子,因此,本文进一步对ZNFD在特定的信号通路中是否有转录调控作用进行了分析。运用Dual-荧光酶报道基因分析系统来检测ZNFD是否对AP1（PMA）, GRE, SRE, p53, CRE, HSE, NF-κB和AP1的信号路径有转录调控作用,且ZNFD蛋白对AP1（PMA）有剂量依耐性激活。数据表明ZNFD蛋白导致AP1（PMA）转录活性的增强,pAP1（PMA）-TA-luc质粒含有AP1元件,该质粒专门用来监控蛋白激酶C转导路径的转录调控作用。这说明ZNFD可能作为蛋白激酶C信号途径的转录激活因子来介导调控细胞的一系列功能。另外,串联亲和纯化（TAP）为一种两步亲和纯化方法,该方法适用于分离类似生理条件下的蛋白互作复合体,因此我们构建了TAP-ZNFD真核表达载体,为后续寻找ZNFD互作蛋白奠定基础。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-9
第一章引言  9-18
第二章对 ZNFD 基因及蛋白的生物信息学分析、目的基因的克隆  18-29
  1.材料与试剂  18-20
  2.实验方法  20-22
  3.实验结果和分析  22-28
  4.讨论  28-29
第三章 ZNFD 组织表达谱分析及细胞亚定位分析  29-38
  1.材料与试剂  29-31
  2.实验方法  31-34
  3.实验结果和分析  34-36
  4.讨论  36-38
第四章 ZNFD 在细胞信号通路中的转录调控分析与 TAP-ZNFD 重组质粒的构建  38-54
  1.材料与试剂  39-41
  2.实验方法  41-47
  3.实验结果和分析  47-52
  4.讨论  52-54
第五章总结与展望  54-56
参考文献  56-66
攻读硕士学位期间发表的学术论文  66-67
致谢  67-68

C_2H_2型锌指蛋白--ZNFD的生物学功能初探

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