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大豆和芸豆子叶中抗毒素诱导及菜豆素抗肿瘤活性研究

作　者: 冯东岳
导　师: 石波
学　校: 中国农业科学院
专　业: 农产品质量与食物安全
关键词: 植物抗毒素 大豆抗毒素 菜豆素 寡糖 乳腺癌细胞 子宫癌细胞
分类号: Q946
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


植物抗毒素是植物防御体系的重要组成部分，在植株体内被诱导合成的次生代谢产物，其作为食品功能性成份研究受到广泛关注。植物抗毒素具有多种生物活性，如类雌激素作用、抗氧化作用等，对预防人类疾病具有重要应用价值。本文以大豆和芸豆为材料，应用分析型高效液相色谱仪、制备型高效液相色谱仪、超高压液相色谱串联四级杆质谱联用仪、MTT比色法等试验技术，研究了大豆经硝酸银诱导产生次生代谢产物大豆抗毒素，对不同大豆品种的大豆抗毒素生成量进行比较，对大豆抗毒素生成机理进行初步分析；同时，研究了芸豆经不同寡糖诱导产生次生代谢产物菜豆素，选择乳腺癌细胞和宫颈癌细胞为靶细胞，研究菜豆素对其生长抑制效应。主要结论如下：1．实验以10mM硝酸银为诱导剂，对9种不同黄豆、青豆和黑豆诱导产生大豆抗毒素的生成量进行比较。结果表明在温度25℃，湿度50%，黑暗培养3d的条件下，黄豆、青豆和黑豆诱导产生的大豆抗毒素生成量差异较大，本实验大豆抗毒素生成量顺序为青豆＞黑豆＞黄豆。大粒青、六月白和关青豆三个青豆品种大豆抗毒素生成量平均值为980μg/g干豆重；青仁乌、黑皮大豆和Peking黑小豆三个黑豆品种大豆抗毒素生成量平均值为750μg/g干豆重；中黄30、中黄56和中品662三个黄豆品种大豆抗毒素生成量平均值为470μg/g干豆重。同时，9个品种的大豆抗毒素生成量也存在较大差异，从高到低顺序为：六月白为1720μg/g干豆重、青仁乌为1360μg/g干豆重、大粒青为1030μg/g干豆重、中黄30为780μg/g干豆重、Peking黑小豆为590μg/g干豆重、中品662为390μg/g干豆重、黑皮大豆为310μg/g干豆重、中黄56为240μg/g干豆重、关青豆为180μg/g干豆重。2．应用HPLC方法，研究了中黄30和青仁乌经10mM硝酸银处理后，大豆抗毒素、大豆苷和大豆苷元的变化关系，分析青仁乌大豆抗毒素生成量较中黄30高的原因。由于大豆苷元是大豆抗毒素合成的主要前体物质，实验结果表明：青仁乌与中黄30相比较，由于自身大豆苷元具有较高水平，以及硝酸银诱导产生大豆苷元较多；同时，青仁乌中的大豆苷元向大豆苷方向转化较中黄30弱，决定了青仁乌的大豆苷元主要向大豆抗毒素方向转化，大豆抗毒素生成量要高于中黄30。实验结果表明在生产中可以选择青仁乌作为原料诱导生成大豆抗毒素。3．应用壳寡糖、果胶寡糖、纤维二糖、褐藻酸寡糖作为诱导剂，诱导芸豆生成菜豆素，通过定性检测方法（HPLC、UPLC-MS/MS）对菜豆素进行鉴定确认，并比较不同寡糖诱导菜豆素效果。结果表明，四种寡糖均可诱导芸豆生成菜豆素，且不同寡糖的最佳诱导浓度不同。在1%，2%，4%，6%和8%五种浓度条件下，壳寡糖和褐藻酸寡糖的最佳诱导浓度是4%，生成量分别是221.32μg/g干豆重和149.50μg/g干豆重；果胶寡糖的最佳诱导浓度是6%，生成量是265.86μg/g干豆重；纤维二糖的最佳诱导浓度是8%，生成量是211.30μg/g干豆重。4．应用MTT方法，选择乳腺癌细胞（Cal-51、Mcf-7）和宫颈癌细胞（Hela、Caski）为靶细胞，检测菜豆素对其抑制效果。结果表明菜豆素对四种细胞生长均具有明显抑制作用，且随着浓度增加，抑制作用增强。在50μg/ml条件下，抑制效果由强到弱的顺序：Cal-51为93.01%，Caski为89.68%，Hela为81.90%，Mcf-7为66.49%。此外，选择了Hela细胞和Mcf-7细胞，应用生物统计学软件SPSS计算菜豆素对两种细胞的IC50，结果分别为36.31μg/ml和46.73μg/ml。

全文目录


附件  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-15
英文缩略表  15-16
第一章 绪论  16-32
  1.1 植物抗毒素（PHYTOALEXINS）  16-21
    1.1.1 植物抗毒素定义  16-17
    1.1.2 植物雌激素概述  17-21
  1.2 大豆抗毒素（GLYCEOLLINS）研究进展  21-25
    1.2.1 大豆抗毒素的发现  21
    1.2.2 大豆抗毒素的生成途径  21-23
    1.2.3 大豆抗毒素的生物学活性  23
    1.2.4 大豆品种对大豆抗毒素累积量的影响  23-24
    1.2.5 诱导剂对大豆抗毒素累积量的影响  24-25
  1.3 菜豆素（PHASEOLLIN）研究进展  25
  1.4 功能性寡糖简介  25-28
  1.5 大豆抗毒素的检测方法  28-29
    1.5.1 高效液相色谱法  28
    1.5.2 高效液相色谱―质谱法（HPLC–MS）  28
    1.5.3 毛细管电泳法（CE）  28-29
  1.6 研究目的意义  29-30
  1.7 研究内容和目标  30-31
    1.7.1 大豆抗毒素研究  30
    1.7.2 菜豆素研究  30-31
  1.8 技术路线  31-32
第二章 硝酸银诱导不同大豆品种的大豆抗毒素生成量比较  32-44
  2.1 引言  32
  2.2 实验材料与设备  32-33
    2.2.1 实验材料与试剂  32-33
    2.2.2 实验设备与仪器  33
  2.3 实验方法  33-35
    2.3.1 硝酸银诱导生成大豆抗毒素  33-34
    2.3.2 大豆抗毒素制备  34
    2.3.3 大豆抗毒素含量标准曲线绘制  34
    2.3.4 大豆抗毒素检测  34
    2.3.5 大豆抗毒素质谱鉴定  34-35
  2.4 结果与分析  35-43
    2.4.1 大豆抗毒素的诱导  35-36
    2.4.2 大豆抗毒素的检测与鉴定  36-39
    2.4.3 硝酸银诱导黄豆、黑豆和青豆的大豆抗毒素生成量比较  39-43
  2.5 本章小结  43-44
    2.5.1 黄豆、黑豆和青豆生成大豆抗毒素比较  43
    2.5.2 九种大豆生成大豆抗毒素比较  43-44
第三章 硝酸银诱导中黄 30 和青仁乌生成大豆抗毒素规律初步研究  44-60
  3.1 引言  44
  3.2 实验材料与设备  44-46
    3.2.1 实验材料与试剂  44-45
    3.2.2 实验设备与仪器  45-46
  3.3 实验方法  46
    3.3.1 大豆抗毒素的诱导  46
    3.3.2 大豆抗毒素的制备  46
    3.3.3 HPLC 检测大豆抗毒素、大豆苷元和大豆苷  46
  3.4 结果与分析  46-59
    3.4.1 大豆苷和大豆苷元紫外吸收光谱图  46-47
    3.4.2 硝酸银诱导中黄 30 生成大豆抗毒素规律初步分析  47-53
    3.4.3 硝酸银诱导青仁乌生成大豆抗毒素规律初步分析  53-59
  3.5 本章小结  59-60
    3.5.1 大豆苷元对大豆抗毒素生成的影响  59
    3.5.2 大豆苷对大豆抗毒素生成的影响  59-60
第四章 不同寡糖诱导芸豆的菜豆素生成量比较  60-71
  4.1 引言  60
  4.2 实验材料与设备  60-61
    4.2.1 实验材料与试剂  60-61
    4.2.2 实验设备与仪器  61
  4.3 实验方法  61-63
    4.3.1 寡糖诱导菜豆素  61-62
    4.3.2 菜豆素的 HPLC 检测  62
    4.3.3 菜豆素的鉴定  62-63
  4.4 结果与分析  63-70
    4.4.1 菜豆素标准曲线绘制  63
    4.4.2 菜豆素的 HPLC 检测  63-65
    4.4.3 菜豆素的鉴定  65-66
    4.4.4 不同寡糖溶液诱导芸豆生成菜豆素比较  66-70
  4.5 本章小结  70-71
第五章 菜豆素体外抗肿瘤细胞实验  71-80
  5.1 引言  71-72
  5.2 实验材料与设备  72-73
    5.2.1 实验材料与试剂  72
    5.2.2 实验设备与仪器  72-73
  5.3 实验方法  73
    5.3.1 细胞培养  73
    5.3.2 菜豆素体外抗肿瘤实验  73
  5.4 结果与分析  73-79
    5.4.1 菜豆素体外抗肿瘤实验  73-77
    5.4.2 Hela 和 Mcf-7 两种细胞的 IC50  77-79
  5.5 本章小结  79-80
第六章 结论与建议  80-83
  6.1 结论  80-82
    6.1.1 黄豆、黑豆和青豆经硝酸银诱导大豆抗毒素生成量比较  80
    6.1.2 不同品种大豆经硝酸银诱导大豆抗毒素生成量比较  80
    6.1.3 硝酸银诱导青仁乌大豆抗毒素生成量高于中黄 30 分析  80-81
    6.1.4 不同寡糖诱导芸豆的菜豆素生成量比较  81
    6.1.5 菜豆素体外对 Cal-51, Caski, Hela 肿瘤细胞抑制效果  81-82
  6.2 创新点  82
  6.3 存在不足和建议  82-83
参考文献  83-99
致谢  99-100
作者简历  100

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物生物化学
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