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AtRHED通过铵离子调节拟南芥根毛发育的电生理机制

作　者: 杨凤博
导　师: 宋纯鹏
学　校: 河南大学
专　业: 植物学
关键词: 根毛 AtRHED NH4+电流膜片钳
分类号: Q945
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

根系是陆生植物的重要营养器官，在植物的生长发育过程中有着不可估量的作用，除了能固定植物外，还能从土壤中吸收各种营养物质，分泌有机物质，与微生物相互作用，根毛的存在进一步增加了其作用的表面积。根毛的生长发育过程是典型的极性生长，对此前人已有较多的研究，但其机制及其影响因素还有待进一步的探讨。氮是植物所需的大量元素之一，铵态氮和硝态氮是植物根系吸收氮的主要形态，它们除了能够提供给植物营养外，还对植物根系形态的建成有一定的影响作用。AtRHED是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，生物信息学分析该蛋白是一个膜蛋白，拥有膜外区，跨膜区及胞内激酶区。本实验室前期研究发现AtRHED基因缺失的突变体表现为根毛长度的极度变短，而在缺乏铵离子的培养基中表型能够得到恢复，表明AtRHED可能与铵离子共同作用参与调控根毛的生长发育。本研究首先改良并优化了根毛细胞原生质体的分离方法，然后根据拟南芥叶肉细胞液泡的分离方法，成功分离出拟南芥根毛细胞的活体液泡，之后利用膜片钳技术，首先确定了在模式植物拟南芥中记录铵离子电流的方法，然后又记录了野生型和AtRHED基因缺失的突变体在全细胞模式和全液泡模式下的铵离子电流，结果发现野生型与突变体相比，在细胞膜上，向内透过较少的铵离子，液泡膜上向内透过较多的铵离子，而突变体恰恰相反，铵离子大量透过细胞膜进入细胞，很少通过液泡膜进入液泡，差异明显，因此可知突变体与野生型根毛生长发育的差异与此有关。综上所述，AtRHED通过调控NH₄⁺的吸收及其在根毛细胞中的分布变化来参与调控根毛的生长发育。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-10
缩写词  10-12
1 前言  12-28
  1.1 根的作用及结构  12-13
  1.2 根毛在植物生长中的作用  13
  1.3 根毛的发育过程  13-16
    1.3.1 表皮细胞的特异化  13-15
    1.3.2 根毛的发生和顶端生长  15-16
  1.4 影响根毛发育过程的因素  16-23
    1.4.1 Ca~(2+)在根毛顶端生长中的作用  16
    1.4.2 活性氧对根毛顶端生长的影响  16-18
    1.4.3 pH 与植物根毛发育生长的关系  18-19
    1.4.4 细胞骨架对根毛生长发育的影响  19-20
    1.4.5 外界营养成分对根毛的影响  20
    1.4.6 与根毛生长相关的激素信号  20-21
    1.4.7 根毛形态建成有关的基因  21-23
  1.5 铵离子的作用及其吸收方式  23-24
    1.5.1 铵离子对植物生长发育的作用  23
    1.5.2 植物吸收铵离子的方式  23-24
  1.6 蛋白激酶在植物生长中的作用  24-25
  1.7 膜片钳技术及其应用  25-26
  1.8 立题依据  26-28
2 材料与方法  28-38
  2.1 实验材料  28
  2.2 实验试剂  28
  2.3 实验溶液  28-30
    2.3.1 常用溶液  28-29
    2.3.2 拟南芥叶肉原生质体的瞬时表达所用溶液  29
    2.3.3 分离拟南芥根毛生质体所用溶液  29-30
    2.3.4 分离拟南芥细胞液泡所用溶液  30
    2.3.5 膜片钳记录所用溶液  30
  2.4 试验中所用引物  30-31
  2.5 试验方法  31-38
    2.5.1 拟南芥的种植  31
    2.5.2 拟南芥总的 RNA 提取  31
    2.5.3 反转录制备拟南芥 cDNA  31-32
    2.5.4 DNA 的琼脂糖凝胶电泳  32
    2.5.5 重组载体的构建  32-34
    2.5.6 制备及转化感受态农杆菌（GV3101）  34-35
    2.5.7 农杆菌（GV3101）转化拟南芥及转基因植物的筛选  35
    2.5.8 PEG 介导的拟南芥叶肉细胞原生质体的瞬时表达  35-36
    2.5.9 根毛原生质体的分离  36
    2.5.10 原生体活性检验方法  36
    2.5.11 液泡的分离  36
    2.5.12 膜片钳技术及其记录方式  36-38
3 实验结果与分析  38-50
  3.1 实验材料与药品的选择  38-42
    3.1.1 实验材料的选择  38
    3.1.2 根毛原生质体的获得及活性检测  38-39
    3.1.3 膜片钳实验中所用药品的选择  39-42
  3.2 全细胞模式下记录铵离子电流  42-45
    3.2.1 铵离子电流记录方法的确认  42-44
    3.2.3 野生型和突变体的电流差异  44-45
  3.3 全液泡模式下记录铵离子电流  45-50
    3.3.1 p1300GFP- AtTPK1、p1300GFP-AtCAT2 重组质粒的构建  45
    3.3.2 转 p1300GFP- AtTPK1 和 p1300GFP-AtCAT2 基因植株的获得  45-46
    3.3.3 叶肉细胞和根毛细胞中活性液泡的获得  46-47
    3.3.4 液泡膜上所记电流差异  47-50
4 讨论  50-54
  4.1 根毛原生质体的分离  50-51
  4.2 根毛原生质体中活体液泡的分离  51
  4.3 铵离子电流的确定  51
  4.4 细胞膜和液泡膜的电流记录  51-52
  4.5 AtRHED 和铵转运体的关系  52-54
5 结论  54-56
6 展望  56-60
  6.1 AtRHED 影响根毛细胞对铵离子的吸收  57
  6.2 AtRHED 可能是胞内铵离子感受体  57
  6.3 AtRHED 影响根毛细胞中的 Ca2+通道  57-58
  6.4 AtRHED 可能受细胞内部的一些植物激素调控  58-60
参考文献  60-70
致谢  70-71

AtRHED通过铵离子调节拟南芥根毛发育的电生理机制

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