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烟酸发酵条件的优化及菌株鉴定

作　者: 钱深
导　师: 杨生玉
学　校: 河南大学
专　业: 微生物学
关键词: 腈水解酶烟酸筛选鉴定优化
分类号: TQ920.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

烟酸又称尼古丁酸、维生素B₃、吡啶-3-甲酸，是维持人体生理机能所必需的维生素，目前烟酸主要用于饲料添加剂、医药、食品行业、化工行业等，市场上的刚性需求强。目前烟酸的合成主要分为有化学合成法和生物合成法两种，化学合成法是目前市场上所采用的主要生产手段，但是化学合成法的生产成本比较高，对设备的要求严格，纯化回收过程复杂，对环境的污染较为严重。而生物合成作为近年来烟酸制备的新手段，可以克服化学合成中的不利因素，具有很大的发展前景。生物法生产烟酸主要是利用生物体内的腈水解酶作为生物催化剂，以3-氰基吡啶作为底物催化生成烟酸。本课题对产腈水解酶菌株生产烟酸做了相关研究，具体如下：1．产腈水解酶菌株的筛选。制备以3-氰基吡啶作为唯一氮源的筛选培养基，作为筛选培养基，从腈化物含量相对偏高的土壤或水样中分离筛选出72株能够在筛选培养基上生长并长势良好的菌株，然后用微量Berthelot法（苯酚-次氯酸盐光度法）间接测定产物浓度，最终筛选得到一株活性最高的菌株T-1。2．菌种的鉴定。对筛选出腈水解酶产生菌的T-1菌株进行菌落形态、显微观察、生理生化特性反应。依据《伯杰氏细菌鉴定手册》以及《常用细菌鉴定手册》，并且比较T-1菌株和标准菌株的特性进行分析，初步鉴定T-1菌株为肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种。3.对筛得的菌株T-1进行发酵条件优化。首先利用单因素试验分析，对腈水解酶发酵培养基的组分及条件进行优化，确定各因素的最适值：葡萄糖1.2%、酵母膏0.6%、K₂HPO₄0.05%、 KH₂PO₄0.05%、MgSO₄·7H₂O0.02%、己内酰胺0.2%、烟腈0.2%，最适产酶温度为28℃，pH7.0，摇床转速200rpm。在此基础上利用正交试验及响应面回归分析法对产酶培养基进行进一步优化，得出最佳培养基组成为：葡萄糖1.0%、酵母膏0.77%、 K₂HPO₄0.05%、 KH₂PO₄0.05%、MgSO₄·7H₂O0.02%、烟腈0.11%、己内酰胺0.2%、28℃、pH7.0、200rpm。响应面优化后的酶活为20.82U/mL，酶活单位提升113.5%。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-7
目录  7-10
1 前言  10-20
  1.1 烟酸概括  10-12
    1.1.1 烟酸简介  10
    1.1.2 烟酸的用途  10-12
  1.2 烟酸的化学合成法  12-14
    1.2.1 气相氧化法  12-13
    1.2.2 液相氧化法  13-14
    1.2.3 电化学氧化法  14
  1.3 烟酸的微生物合成法  14-15
    1.3.1 微生物法的基本原理  14-15
    1.3.2 影响腈水解酶合成烟酸的因素  15
  1.4 烟酸的市场需求与前景展望  15-17
    1.4.1 国际市场需求及生产现状  16-17
    1.4.2 国内市场需求及生产现状  17
  1.5 本课题的意义和研究的内容  17-20
    1.5.1 本课题的意义  17-18
    1.5.2 课题研究内容  18-20
2 材料与方法  20-32
  2.1 材料  20-24
    2.1.1 菌株  20
    2.1.2 培养基  20-21
    2.1.3 主要药品  21-23
    2.1.4 主要试剂的配置  23
    2.1.5 主要仪器  23-24
  2.2 试验方法  24-32
    2.2.1 产腈水解酶菌株的筛选  24
    2.2.2 细菌初步鉴定  24-26
    2.2.3 生长曲线的绘制  26-27
    2.2.4 反应液中烟酸的检测方法  27
    2.2.5 标准曲线的绘制  27-28
    2.2.6 酶活力测定  28
    2.2.7 培养条件优化  28-31
    2.2.8 数据以及图标的处理方法  31-32
3 结果与讨论  32-52
  3.1 菌种的筛选  32-34
    3.1.1 最高酶活菌株的确定  32-33
    3.1.2 目的酶产生菌分布情况  33-34
    3.1.3 小结  34
  3.2 细菌初步鉴定  34-35
    3.2.1 形态观察  34-35
    3.2.2 生理生化实验  35
  3.3 生长曲线的绘制  35-36
  3.4 NH_3标准曲线的绘制  36-37
  3.5 发酵条件优化  37-52
    3.5.1 单因素试验  37-44
    3.5.2 正交试验  44-45
    3.5.3 响应面法优化发酵培养基  45-49
    3.5.4 验证试验  49
    3.5.5 小结  49-52
4 结论  52-54
5 展望  54-56
参考文献  56-60
致谢  60-61

烟酸发酵条件的优化及菌株鉴定

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