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H9N2亚型AIV山东分离株全基因序列分析及其在豚鼠间的传播

作　者: 魏宝之
导　师: 柴同杰
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: H9N2亚型AIV 序列分析跨种属病毒气溶胶感染剂量
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

禽流感（Avian influenza,AI）是由禽流感病毒（AIV）引起的危害最严重的家禽传染病之一。该病于1878年首先发现于意大利，随后波及多个国家和地区，尤其是低致病性的H9N2亚型AIV的广泛流行给世界的养禽业造成了巨大的经济损失，虽然H9N2亚型AIV具有低致病性，但是当它与其他病原混合感染时能够导致很高的发病率和死亡率。陈伯伦在1994年首次分离到H9N2亚型AIV，证实了H9N2亚型AIV在我国的存在（陈伯伦等，1994）。研究发现，H9N2亚型AIV于2009年冬季到2010年春季曾在我过山东地区造成了广泛的流行。为了加强对我国山东地区H9N2亚型禽流感病毒基因组遗传变异情况的监测，本研究以一株2008年山东省分离的H9N2亚型禽流感病毒（A/Chicken/Shandong/01/2008）为研究对象，利用RT-PCR方法将扩增的该病毒的8个基因片段连接到pMD18-T载体上，将连接产物转化入Top10感受态细胞中，重组质粒经酶切鉴定为阳性后进行序列测定。序列测定完成后用专业分析软件与国内外H9N2亚型AIV代表毒株的相应基因序列进行同源性比较和遗传进化分析。结果表明该山东分离株起源于欧亚群系，与该群系代表毒株的相应基因具有很高的同源性，可能具有共同的祖先；通过对其血凝素裂解位点氨基酸组成的分析发现其HA裂解位点处的氨基酸序列为P-A-R-S-S-R，属于低致病性H9N2亚型AIV；通过对其血凝素受体结合位点的分析发现该病毒HA蛋白第234位为亮氨酸，表明该分离株能够与哺乳动物唾液酸受体相结合而感染哺乳动物。为了研究该病毒在哺乳动物间的传染能力，本研究以豚鼠为实验动物，分为接种组、接触感染组和气溶胶被动感染组。定期采集豚鼠鼻洗液，检测鼻洗液中的AIV，确定排毒情况；同时定期用AGI-30采集隔离器中的空气样品，以确定其中AIV气溶胶的浓度；采集豚鼠的血液样品，以检测其抗体滴度。结果表明，在攻毒后第6~10天均能检测到AIV气溶胶，其浓度在第8天左右达到高峰，为1.19×105copies/m3air；接种组和接触感染组的豚鼠分别在攻毒后第2天和第4天检测到排毒，气溶胶被动感染组始终没有检测到排毒；接种组和接触感染组分别在第7天和第14天检测到抗体，气溶胶被动感染组始终没有检测到抗体。这表明，豚鼠人工接种AIV之后可通过鼻腔排出病毒，污染饲料和饮水之后能引起与其接触的健康豚鼠的感染，并且排出的病毒能形成气溶胶，随空气流通传播。同时本实验对AIV经气溶胶感染途径对豚鼠的感染剂量进行了研究。利用气溶胶发生器产生病毒气溶胶，将豚鼠放在有病毒气溶胶的环境中暴露感染60分钟，通过检测豚鼠的排毒情况判定是否发生感染，计算气溶胶的半数感染剂量（aID50）。结果表明，病毒气溶胶的半数感染量（aID50）为1.32×105copies/L air。这说明H9N2亚型AIV病毒气溶胶在实验条件下可以感染哺乳动物，其气源性传播将对人类公共卫生安全具有很大的威胁。

全文目录

符号说明  5-9
中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1 引言  13-27
  1.1 禽流感的流行现状  13-14
  1.2 禽流感病毒的生物学特性  14-15
  1.3 禽流感病毒的基因组结构  15-19
    1.3.1 血凝素蛋白（HA）  16
    1.3.2 神经氨酸酶（NA）  16-17
    1.3.3 聚合酶蛋白（PB2、PB1、PA）  17
    1.3.4 核蛋白（NP）  17-18
    1.3.5 基质蛋白（M）  18
    1.3.6 非结构蛋白（NS）  18-19
  1.4 AIV 的遗传变异  19-20
    1.4.1 抗原性变异  19-20
    1.4.2 致病性变异  20
  1.5 AIV 跨种属感染的研究进展  20-22
  1.6 AIV 造成的危害  22-24
    1.6.1 AIV 对畜牧业的危害  22
    1.6.2 AIV 对人类的危害  22-24
  1.7 AIV 的诊断方法  24
  1.8 AIV 的预防及控制  24-25
  1.9 研究的目的和意义  25-27
2 材料与方法  27-38
  2.1 试验材料  27-29
    2.1.1 病毒株  27
    2.1.2 实验动物和 SPF 鸡胚  27
    2.1.3 分子生物学试剂  27
    2.1.4 主要试剂及配制方法  27-28
    2.1.5 主要仪器设备  28-29
  2.2 方法  29-38
    2.2.1 H9N2 亚型禽流感病毒全基因克隆测序及序列分析  29-35
    2.2.2 H9N2 亚型禽流感病毒在豚鼠间的传播试验  35-37
    2.2.3 H9N2 亚型禽流感病毒气溶胶的感染剂量  37-38
3 结果与分析  38-52
  3.1 H9N2 亚型禽流感病毒全基因序列分析结果  38-49
    3.1.1 RT-PCR 电泳结果  38-40
    3.1.2 A/Chicken/Shandong/01/2008 分离株全基因组的测序结果  40
    3.1.3 A/Chicken/Shandong/01/2008 分离株全基因核苷酸序列比较结果  40-41
    3.1.4 A/Chicken/Shandong/01/2008 分离株 HA 蛋白关键氨基酸位点的比较  41-42
    3.1.5 A/Chicken/Shandong/01/2008 分离株 NA 蛋白关键氨基酸位点的比较  42-43
    3.1.6 A/Chicken/Shandong/01/2008 分离株 PB2、PB1 和 PA 基因的序列分析  43-44
    3.1.7 A/Chicken/Shandong/01/2008 分离株 M、NP 和 NS 基因的序列分析  44
    3.1.8 A/Chicken/Shandong/01/2008 分离株各基因的系统发生树分析  44-49
  3.2 H9N2 亚型禽流感病毒在豚鼠间的传播试验结果  49-50
    3.2.1 实验动物排毒检测结果  49
    3.2.2 血清中 AIV 抗体检测结果  49-50
    3.2.3 隔离器中气载 H9N2 亚型 AIV 的检测结果  50
  3.3 H9N2 亚型禽流感病毒气溶胶感染剂量的测定结果  50-52
4 讨论  52-55
5 结论  55-56
参考文献  56-64
致谢  64-65
攻读学位期间发表论文及奖励  65

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