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比格犬ERβ剪切异构体蛋白定位及其RNAi慢病毒载体的构建及筛选

作　者: 甘艺
导　师: 杨焕民；胡仲明
学　校: 黑龙江八一农垦大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 雌激素β受体剪切异构体 RNA干涉 慢病毒 蛋白定位
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


比格犬广泛应用于国家二类以上新药研发，但比格犬在繁殖方面出现了不发情、发情不孕、休情期长、窝产仔数减少等现象，为了探讨该犬繁殖性能降低的机理，本研究对ERβ剪切异构体的蛋白定位及其生物学功能进行研究。通过构建ERβ剪切异构体重组真核表达载体，瞬时转染HEK293T细胞，检测目的蛋白在体外细胞表达及定位情况；建立稳定表达ERβ剪切异构体细胞系；构建针对目的基因慢病毒介导RNA干涉表达载体，利用荧光定量PCR方法和Western Blot方法在mRNA水平和蛋白水平上检测对目的基因干涉效果。结果表明：成功构建比格犬ERβ剪切异构体MYC标签重组真核表达载体，WB结果显示，ERβ1293编码430aa，蛋白量大小为48kDa；ERβ1257编码419aa，蛋白量大小为47kDa；体外细胞蛋白定位结果表明，ERβ1293主要定位于细胞质，而ERβ1257均主要定位于细胞核；成功构建稳定表达ERβ1293和ERβ1257细胞株，WB结果表明目的基因得到高效的表达；分别针对两条ERβ剪切异构mRNA，各构建三条shRNA序列及一条shNC，并合成于慢病毒载体。qRT-PCR方法从mRNA水平检测干涉效果与WB方法从蛋白水平上检测结果相一致：ERβ1293-shRNA1（p<0.01）和ERβ1293-shRNA3（p<0.01）差异极显著，ERβ1257-shRNA1（p<0.01）、ERβ1257-shRNA3（p<0.01）差异极显著，ERβ1293-shRNA3和ERβ1257-shRNA3的干涉效果最优。实验结论：比格犬ERβ1293和ERβ1257MYC标签重组真核表达载体体外细胞转染蛋白量检测分别为48kDa和47kDa；蛋白定位分别定位于细胞质和细胞核；成功筛选出两条目的基因的有效shRNA序列，进而更深入地探索比格犬ERβ1293和ERβ1257的生物学功能。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-6
英文缩略词表  6-11
第一章 文献综述  11-25
  1.1 ERs  11-13
    1.1.1 ERs 的结构  11
    1.1.2 ERs 相关结合配体  11-12
    1.1.3 ERs 介导的基因转录及调控  12-13
  1.2 ERβ及其剪切异构体的研究进展  13-18
    1.2.1 ERβ简介  13-14
    1.2.2 哺乳动物 ERβ剪切异构体简介  14-17
    1.2.3 ERβ及其剪切异构体与相关雌性生殖系统疾病研究进展  17-18
  1.3 RNA 干涉研究进展  18-22
    1.3.1 RNA 干涉  18
    1.3.2 PTGS 简介  18-20
    1.3.3 RNAi 技术的应用  20-22
  1.4 慢病毒研究进展  22
  1.5 本研究的实验目的和意义  22-25
第二章 比格犬 ERβ1293、ERβ1257 体外细胞蛋白定位分析  25-41
  2.1 试验材料与方法  25-34
    2.1.1 试验材料  25-27
    2.1.2 试验方法  27-34
  2.2 试验结果  34-38
    2.2.1 ERβ1293、ERβ1257 编码序列的克隆  34-35
    2.2.2 ERβ1293、ERβ1257 重组质粒的菌液 PCR 鉴定  35-36
    2.2.3 ERβ1293、ERβ1257 MYC 标签重组质粒的双酶切鉴定  36-37
    2.2.4 ERβ1293、ERβ1257 重组质粒的测序  37
    2.2.5 Western Blot 鉴定 ERβ1293、ERβ1257 MYC 标签重组质粒融合蛋白的表达  37
    2.2.6 ERβ1293、ERβ1257 MYC 标签重组质粒蛋白定位  37-38
  2.3 讨论  38-39
  2.4 结论  39-41
第三章 比格犬 ERβ1293、ERβ1257 稳定表达细胞系的构建  41-49
  3.1 试验材料与方法  41-45
    3.1.1 试验材料  41-43
    3.1.2 试验方法  43-45
  3.2 试验结果  45-46
    3.2.1 筛选 ERβ1293、ERβ1257 阳性克隆细胞  45
    3.2.2 Western Blot 方法检测 ERβ1293、ERβ1257 阳性克隆细胞中表达  45-46
  3.3 讨论  46-48
  3.4 结论  48-49
第四章 比格犬 ERβ1293、ERβ1257 RNAi 重组慢病毒的构建及筛选  49-67
  4.1 试验材料与方法  49-58
    4.1.1 试验材料  49-51
    4.1.2 试验方法  51-58
  4.2 试验结果  58-64
    4.2.1 ERβ1293、ERβ1257 基因 shRNA 序列的设计  58
    4.2.2 荧光定量引物设计  58-59
    4.2.3 慢病毒载体侵染细胞感染复数的测定  59
    4.2.4 Western Blot 检测 ERβ1293、ERβ1257 基因 shRNA 序列对目的蛋白的干涉效果  59-60
    4.2.5 检测提取侵染细胞 RNA 的完整性  60-61
    4.2.6 PCR 法检测荧光引物特异性  61-62
    4.2.7 ERβ1293、ERβ1257 基因和β-actin 基因的标准曲线  62-63
    4.2.8 qRT-PCR 检测 ERβ1293、ERβ1257 干涉序列在 mRNA 水平的定量分析  63-64
  4.3 讨论  64-66
  4.4 结论  66-67
第五章 结论  67-69
参考文献  69-77
致谢  77-79
附录  79-83
个人简历  83

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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