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构巢曲霉高亲和性钙离子吸收系统参与生长发育调控的机制研究

作　者: 王莎
导　师: 陆玲
学　校: 南京师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 钙离子通道 CchA MidA 钙调磷酸酶极性生长产孢细胞壁完整性盐逆境胁迫构巢曲霉
分类号: Q935
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

曲霉属在全球共有上百类不同的霉菌种类,它包含了以黑曲霉、米曲霉为代表的具有经济效益的工业曲霉,还有一类是与侵染性真菌感染相关的烟曲霉、黄曲霉等病原曲霉。由于构巢曲霉和工业真菌、病原真菌有着较近的亲缘关系,另外它作为丝状真菌的模式生物,有其自身独特的优势,可作为研究极性生长和产孢等方面的优良材料。以钙离子介导的信号通路(Ca2+signaling pathway)广泛地参与了真核生物中的各种生理活动过程,包括生长发育、胞吐、细胞骨架的重排、肌肉收缩、趋化性、细胞分裂、分化、程序性细胞死亡等,在酵母中,也发现钙信号系统发挥了重要作用。构巢曲霉虽然与酵母亲缘关系相近,但丝状真菌有其生长所独特的功能,更适用于研究与真菌的侵染力和致病性密切相关的极性生长和产孢的功能基因,本课题就以此为切入点展开深入研究。在真菌中存在两大类不同的钙离子吸收系统,即高亲和性钙离子吸收系统(HACS)和低亲和性钙离子吸收系统(LACS),其中高亲和性钙离子吸收系统由CchA和MidA两个主要组分构成,当胞外钙离子可获得性比较低时,高亲和性钙离子吸收系统就作为主要的钙离子进入通道而发挥作用,反之当胞外钙离子浓度升高后则由低亲和性钙离子吸收系统来行使该功能。本课题通过基因定点敲除技术、乙醇脱氢酶启动子(alcA promoter)替换技术分别构建了敲除菌株和可调控菌株来研究CchA和MidA在构巢曲霉中的功能和特征。在低钙的基础培养基上,当关闭CchA、MidA的表达时,可调控菌株和敲除菌株的表型是完全-致的,它们在基础培养基MMPDR上均表现出明显的产孢缺陷,另外,比较有趣地是,我们发现突变株的产孢缺陷表型与其接种量有一定的关系,接种量越高病态表型越明显,由于突变菌株在菌落上体现出产孢缺陷,为了进一步观察产孢结构的细微差别,我们通过光学显微镜和扫描电镜更清晰直观地展示了突变菌株于野生型在分生孢子梗和分生孢子数量上的差异,但这种产孢缺陷可以通过在胞外添加钙离子和渗透逆境而得到改善；CchA、MidA的缺失不仅会影响菌株的产孢功能,而且也会造成突变菌株的菌丝极性生长丢失,顶端菌丝膨胀突起,再者,突变菌株在菌丝延伸的过程中不时地出现生长拐点和多级分枝,这与野生型菌株在相同的培养调节下的线性生长是有很大区别的；另外,我们还发现突变菌株体现出对细胞壁抑制剂的相对抗性,且细胞壁的主要组分几丁质和葡聚糖的含量均有所增加,该结果也与流式细胞仪上检测到葡聚糖含量增加的情况是一致的。以上现象均表明：CchA、MidA参与了菌丝主轴极性生长、产孢以及细胞壁的完整性等多方面的生理活动并发挥了重要的作用。与此同时,我们还发现CchA、MidA单敲和双敲菌株在以上方面均表现出类似的表型,这也就提示我们CchA和MidA在构巢曲霉中可能是以复合体的形式存在,并共同行使作用,通过酵母双杂交的阳性结果又进一步为该结论提供了强有力的依据。接下来,为了对钙信号系统进行深入研究,我们把目标锁定在了其下游蛋白钙调磷酸酶(Calcineurin),之前研究表明钙调磷酸酶是钙信号通路中的枢纽蛋白,于是我们就对Calcineurin和钙离子通道蛋白CchA在生长发育过程中的相互调节关系展开研究。我们发现在正常的生长状态下,Calcineurin和CchA的双敲菌株加成了各自单敲菌株的缺陷表型,而在应答离子逆境胁时,在Calcineurin单敲菌株的菌丝极性生长没有得到恢复的情况下,Calcineurin与CchA的双敲菌株的极性生长反而得到了明显的恢复,这说明在不受到任何胁迫的刺激下,Calcineurin和CchA不是简单的上下游关系,除了CchA是Calcineurin的上游外,还有在其他平行通路方面有各自独特的功能,但在应答离子渗透逆境胁迫时,Calcineurin和CchA则体现出反向调节的作用。综上所述,本课题以构巢曲霉模式生物为研究对象,系统研究了高亲和性钙离子吸收系统及钙调磷酸酶Calcineurin在共同调节曲霉形态建成中的功能,具体描述了高亲和性钙离子吸收系统在真菌极性生长、产孢和细胞壁完整方面所发挥的功能以及钙离子通道CchA和Calcineurin生离子盐逆境等条件下对极性生长的相互调节作用以及相应的作用机理,这不仅为探索钙信号系统的细胞学功能提供理论知识,也可为工业真菌生长状态的改善和代谢产物量的增加提供指导,并为人类相关基因的功能的研究提供借鉴,更重要的是弄清楚真菌形态建成调控网络为有效控制真菌的生长和繁殖可以提供有效的靶点,具有非常重要的意义。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-8
目录  8-12
第1章绪论  12-28
  1.1 极性生长的研究进展  12-16
    1.1.1 影响菌丝极性生长的顶体  13-14
    1.1.2 丝状真菌极性生长的菌丝顶端模型  14-16
  1.2 构巢曲霉产孢过程的研究进展  16-20
    1.2.1 产孢的介绍  16
    1.2.2 产孢的形成过程  16-19
    1.2.3 产孢的生理学需求  19-20
  1.3 钙信号系统主要组分及功能  20-25
    1.3.1 钙离子  21-22
    1.3.2 四种钙离子通道蛋白  22-23
    1.3.3 钙调磷酸酶  23-25
  1.4 本课题的研究内容、思路及方法  25-28
    1.4.1 研究内容  25-26
    1.4.2 研究思路与技术路线  26-27
    1.4.3 研究方法  27-28
第2章构巢曲霉钙离子通道蛋白CchA、MidA的信息学和系统进化分析  28-37
  2.1 材料与方法  28-29
    2.1.1 数据库、网络服务器(Web Server)和生物软件  28-29
    2.1.2 系统进化分析的技术路线和分析方法  29
  2.2 实验结果  29-36
    2.2.1 构巢曲霉CchA蛋白结构和生物信息学分析  29-32
    2.2.2 构巢曲霉MidA蛋白结构和生物信息学分析  32-34
    2.2.3 构巢曲霉CchA和相关物种同源蛋白的同源性分析  34-35
    2.2.4 构巢曲霉MidA和相关物种同源蛋白的同源性分析  35-36
  2.3 本章小结与讨论  36-37
第3章构巢曲霉CchA、MidA、CnaB敲除菌株的构建及鉴定  37-57
  3.1 材料与方法  39-46
    3.1.1 菌种、质粒及培养条件  39
    3.1.2 试剂与仪器  39-40
    3.1.3 cchA,midA,cnaB基因敲除的引物设计  40-41
    3.1.4 cchA/midA双敲菌株的引物设计  41-42
    3.1.5 融合PCR  42-43
      3.1.5.1 扩增全长的各组成片段  42-43
      3.1.5.2 融合PCR(Fusion PCR)  43
    3.1.6 构巢曲霉原生质体的制备及转化  43-44
    3.1.7 重组子的初步筛选  44
    3.1.8 A.nidulans基因组DNA的提取  44
    3.1.9 DIG特异性探针的制备  44-45
    3.1.10 A.nidulans转化子的Southern Blotting免疫印迹验证  45-46
  3.2 实验结果  46-55
    3.2.1 △cchA转化子诊断PCR验证结果  46-48
    3.2.2 △cchA转化子southern blotting印迹杂交验证结果  48-49
    3.2.3 △midA转化子诊断PCR验证结果  49-50
    3.2.4 △midA转化子southern blotting印迹杂交验证结果  50-51
    3.2.5 △cnaB转化子诊断PCR验证结果  51-53
    3.2.6 △cchA/△midA转化子诊断PCR验证结果  53-55
  3.3 本章小结与讨论  55-57
第4章构巢曲霉中钙离子通道蛋白CchA、MidA在菌丝生长发育中的生物学功能  57-78
  4.1 CchA、MidA参与构巢曲霉产孢功能的研究  58-66
    4.1.1 CchA、MidA在低钙环境下的产孢缺陷  58-61
      4.1.1.1 材料与方法  58-59
        4.1.1.1.1 菌种及培养条件  58-59
        4.1.1.1.2 试剂与仪器  59
        4.1.1.1.3 实验方法  59
      4.1.1.2 实验结果  59-61
    4.1.2 CchA、MidA敲除菌株产孢结构显微图  61-64
      4.1.2.1 材料与方法  61-62
        4.1.2.1.1 菌种及培养条件  61
        4.1.2.1.2 试剂与仪器  61-62
        4.1.2.1.3 显微镜观察  62
        4.1.2.1.4 扫描电镜观察  62
      4.1.2.2 实验结果  62-64
    4.1.3 加钙能恢复CchA、MidA突变菌株的产孢缺陷  64-65
      4.1.3.1 材料与方法  64
        4.1.3.1.1 菌种及培养条件  64
        4.1.3.1.2 试剂与仪器  64
        4.1.3.1.3 实验方法  64
      4.1.3.2 实验结果  64-65
    4.1.4 渗透逆境能恢复CchA、MidA突变菌株的产孢缺陷  65-66
      4.1.4.1 材料与方法  65-66
        4.1.4.1.1 菌种及培养条件  65
        4.1.4.1.2 试剂与仪器  65
        4.1.4.1.3 实验方法  65-66
      4.1.4.2 实验结果  66
  4.2 CchA、MidA参与构巢曲霉极性生长调节的研究  66-70
    4.2.1 材料与方法  67
      4.2.1.1 菌种及培养条件  67
      4.2.1.2 试剂与仪器  67
      4.2.1.3 实验方法  67
    4.2.2 实验结果  67-70
  4.3 CchA,MidA缺失对细胞壁合成抑制剂的抗性及对细胞壁成分影响的研究  70-76
    4.3.1 △cchA,△midA突变菌株对细胞壁合成抑制剂的抗性  70-71
      4.3.1.1 材料与方法  70-71
        4.3.1.1.1 菌种及培养条件  70
        4.3.1.1.2 试剂与仪器  70
        4.3.1.1.3 实验方法  70-71
      4.3.1.2 实验结果  71
    4.3.2 △cchA,△midA突变菌株细胞壁组分含量的检测  71-76
      4.3.2.1 材料与方法  71-74
        4.3.2.1.1 菌种及培养条件  71-72
        4.3.2.1.2 试剂与仪器  72
        4.3.2.1.3 实验方法  72-74
      4.3.2.2 实验结果  74-76
  4.4 本章小结和讨论  76-78
第5章构巢曲霉中钙离子通道蛋白CchA、MidA相互作用的in vitro分析  78-82
  5.1 材料与方法  79-80
    5.1.1 质粒载体及菌种  79
    5.1.2 试剂与仪器  79
    5.1.3 酵母双杂交载体的构建  79
    5.1.4 质粒转化入酿酒酵母  79-80
  5.2 实验结果与讨论  80-82
第6章构巢曲霉中Calcineurin与CchA在生长发育过程中的相互调节作用  82-91
  6.1 Calcineurin和CchA参与构巢曲霉正常极性生长调节的研究  83-85
    6.1.1 材料与方法  83-84
      6.1.1.1 菌种及培养条件  83
      6.1.1.2 试剂与仪器  83-84
      6.1.1.3 菌丝培养及显微镜观察  84
    6.1.2 实验结果  84-85
  6.2 Calcineurin和CchA在渗透逆境下对极性生长调节作用的研究  85-86
    6.2.1 材料与方法  85
      6.2.1.1 菌种及培养条件  85
      6.2.1.2 试剂与仪器  85
      6.2.1.3 菌丝培养及显微镜观察  85
    6.2.2 显微镜观察结果与讨论  85-86
  6.3 Calcineurin和CchA在渗透逆境下对菌落影响的研究  86-88
    6.3.1 材料与方法  86-87
      6.3.1.1 菌种及培养条件  86-87
      6.3.1.2 试剂与仪器  87
      6.3.1.3 实验方法  87
    6.3.2 固体菌落表型结果与讨论  87-88
  6.4 Calcineurin和CchA缺失菌株对细胞壁和细胞膜抑制剂的敏感性测试  88-90
    6.4.1 材料与方法  88-89
      6.4.1.1 菌种及培养条件  88
      6.4.1.2 试剂与仪器  88-89
      6.4.1.3 实验方法  89
    6.4.2 实验结果与讨论  89-90
  6.5 本章小结和讨论  90-91
第7章结论  91-93
附录A  93-95
附录B  95-96
参考文献  96-104
在读期间发表的学术论文及研究成果  104-105
致谢  105

构巢曲霉高亲和性钙离子吸收系统参与生长发育调控的机制研究

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