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金丽假交替单胞菌JG1抑菌机理研究

作　者: 于敏
导　师: 张晓华
学　校: 中国海洋大学
专　业: 微生物学
关键词: 金丽假交替单胞菌 L-氨基酸氧化酶 抑菌小分子物质 全基因组测序 密度感应淬灭
分类号: Q936
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


假交替单胞菌（Pseudoalteromonas）广泛分布于世界各地的海洋环境中，可分为产色素或不产色素两大类，其中产色素菌株的显著特征是能够形成具有多种不同生物活性的代谢产物，如抗细菌、抗真菌、溶藻等活性。目前已从该属菌株中分离纯化出多种具有抑菌活性的小分子化合物、蛋白质、多糖等物质，而对该属菌株基因组的分析也已成为研究其多种生物活性物质产生机制及对不同海洋环境适应性的重要手段。因此，对该属菌株抑菌机理的研究有助于开发新型的有益菌制剂和海洋药物，从而广泛应用于水产养殖病害、生物污损及赤潮等的防治中。本论文分离纯化了金丽假交替单胞菌（Pseudoalteromonas flavipulchra）JG1所产生的多种抑菌物质并对其抑菌机理进行了初步探讨，完成了该菌株的全基因组测序及分析，并对其适应复杂的海洋环境并形成生存优势的能力进行了阐释，为后续对该菌株及其代谢产物的开发利用奠定了理论基础。金丽假交替单胞菌JG1分离自健康大菱鲆养殖海水，对多个种属的菌株具有较强的抑菌活性，如弧菌属、芽孢杆菌属等。通过石油醚﹑乙酸乙酯﹑正丁醇对JG1发酵液上清和菌体样品进行分步萃取，发现菌株JG1发酵液的石油醚层、乙酸乙酯层萃取样品及水层样品均具有抑菌活性。这表明JG1的抑菌物质中既含有某些小分子物质如脂类、糖类、色素类化合物，也包含有大分子蛋白类物质，这两类物质协同作用产生更好的抑菌效果。采用硫酸铵沉淀法、SDS-PAGE及电洗脱法对JG1的胞外蛋白进行了分离纯化，在SDS-PAGE中可见单一条带，且胶内活性检测表明该蛋白对鳗弧菌有较强的抑菌活性。将此抑菌蛋白经De novo测序得到的两条肽段的氨基酸序列与菌株JG1的蛋白质组序列进行比对，获得其基因及氨基酸序列全长，并将其命名为PfaP。PfaP蛋白共由694个氨基酸组成，理论分子量为77.0kDa，理论等电点为4.63，Signal P预测其不含有信号肽序列。氨基酸序列比对结果显示，PfaP蛋白与被囊假交替单胞菌（P. tunicata）D2的L-赖氨酸氧化酶AlpP具有58%的一致性，与地中海海洋单胞菌（Marinomonas mediterranea）MMB-1的抗微生物蛋白marinocine具有54%的一致性。由此推测PfaP蛋白为一种L-氨基酸氧化酶，其抑菌活性是由过氧化氢介导的，过氧化氢酶能够抑制其抑菌活性的产生。对PfaP蛋白的基因序列进行克隆，并分别与表达载体pET24a(+)、pET26b(+)、pET32a(+)、pBAD/Myc-HisB及pRSFDuet-1连接，构建了重组表达菌株Escherichia coli BL21/pET24a(+)/PfaP、E. coli BL21/pET26b(+)/PfaP、E. coliBL21/pET32a(+)/PfaP、E. coli BL21/pBAD/Myc-HisB/PfaP以及E. coli BL21/pRSFDuet-1/PfaP，并在体外诱导表达。PfaP蛋白能够在大肠杆菌中得到异源表达，但可能由于在大肠杆菌中无法对该蛋白进行正确的翻译后修饰，其异源表达产物不能够形成有活性的成熟蛋白。菌株JG1的乙酸乙酯萃取物经多步硅胶柱层析及半制备反相高效液相色谱分析，共分离得到5种具有抑菌活性的单体小分子化合物，分别为对羟基苯甲酸（1）、反式桂皮酸（2）、6-溴吲哚-3-乙酸（3）、N-羟基苯并异恶唑酮（4）和2’-脱氧腺苷（5）。其中，仅带有一个溴原子的化合物3为黄褐色，稀释后呈鲜艳黄色，推测其为菌株JG1形成的一种色素分子，使菌落呈现金黄色。这5种小分子化合物对鳗弧菌均具有抑菌活性，微量稀释法检测最小抑菌浓度分别为1.25、1.25、0.25、0.25和5mg/ml。化合物3的抑菌活性最强，抑菌范围也最广，对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有抑菌活性。由此可见，色素分子与抑菌蛋白的协同作用使菌株JG1表现出良好的抑菌活性。这5种小分子化合物均首次发现能对海水养殖病原菌产生抑制活性。采用Illumina高通量测序技术对JG1的全基因组进行了测序及分析，共预测得到4913个基因，总长度为4,828,917bp，占基因组的87.71%。同时，在JG1基因组中发现预测的104个tRNA编码基因和4个rRNA操纵子。与已知基因组序列的被囊假交替单胞菌（P. tunicata）D2、游海假交替单胞菌（P. haloplanktis）TAC125、大西洋假交替单胞菌（P. atlantica）T6c、2株假交替单胞菌TW-7和SM9913的COG注释基因分布比较显示，菌株JG1中参与次级代谢产物生物合成、转运和分解，氨基酸转运和代谢以及翻译、核糖体结构与起源的相关基因的丰度均为最高，与其能合成丰富的代谢产物的特征相一致。JG1中参与防御机制的基因丰度也较高，表明其具有良好的环境适应能力。通过对JG1基因组的分析，发现了参与合成5种抑菌小分子化合物的相关基因，并预测了这些小分子化合物在JG1中的代谢途径，而抑菌蛋白PfaP也参与了抑菌小分子物质6-溴吲哚-3-乙酸的生物合成过程，进一步表明JG1中的各种抑菌机制是紧密联系的。在JG1的基因组中还发现有大量的多肽类次级代谢产物的编码基因，几丁质酶、密度感应信号分子降解酶等与抗微生物相关的编码基因，以及对氧化压力的抵抗、重金属的抵抗、抗生素及其他药物抵抗的相关基因，表明JG1既能够形成多种拮抗机制以抑制其他微生物的生长，也能够形成良好的自我保护机制，从而适应多变的海洋环境，在微生物群落中形成生长优势。

全文目录


摘要  5-8
Abstract  8-18
第一章 文献综述  18-47
  1 假交替单胞菌概述  18-23
    1.1 假交替单胞菌的一般特征  18-21
    1.2 金丽假交替单胞菌的一般特征  21
    1.3 假交替单胞菌的生态学研究意义  21-23
      1.3.1 水产养殖病害的防治  21-22
      1.3.2 形成生物被膜防止污损的发生  22
      1.3.3 赤潮的防治  22-23
  2 假交替单胞菌产生的生物活性物质  23-29
    2.1 小分子活性物质  23-27
      2.1.1 卤化的小分子活性物质  23-25
      2.1.2 非卤化的小分子活性物质  25-27
    2.2 大分子活性物质  27-29
  3 假交替单胞菌的全基因组测序及分析  29-45
    3.1 被囊假交替单胞菌 D2 的全基因组分析  30-34
      3.1.1 生物活性物质的合成  31
      3.1.2 对表面的粘附及生物被膜的形成  31-32
      3.1.3 对环境压力的感知  32
      3.1.4 营养的获取  32-33
      3.1.5 对多种真核生物表面多聚物的降解  33-34
    3.2 游海假交替单胞菌 TAC125 的全基因组分析  34-40
      3.2.1 基因组结构  35-37
      3.2.2 蛋白质组的一般特征  37
      3.2.3 代谢特征  37-38
      3.2.4 对氧的反应  38-40
    3.3 假交替单胞菌 SM9913 的全基因组分析  40-45
      3.3.1 基因组的一般特征  41-42
      3.3.2 转座元件  42-44
      3.3.3 对活性氧的敏感性  44
      3.3.4 对药物及重金属的抵抗能力  44
      3.3.5 鞭毛和运动性  44-45
  4 本论文的研究目的和意义  45-47
第二章 金丽假交替单胞菌 JG1 抑菌活性检测及抑菌组分分析  47-57
  1 实验材料与仪器  47-49
    1.1 菌株  47-48
    1.2 培养基  48-49
    1.3 主要仪器  49
  2 实验方法  49-50
    2.1 菌株 JG1 抑菌谱的测定  49
    2.2 有机溶剂萃取法对菌株 JG1 抑菌活性组分的分析  49-50
    2.3 不同培养时间对菌株 JG1 胞外抑菌蛋白的影响  50
      2.3.1 不同培养时间 JG1 胞外产物的制备  50
      2.3.2 不同培养时间 JG1 胞外产物的抑菌活性检测  50
  3 实验结果  50-56
    3.1 菌株 JG1 对不同菌株的抑菌谱  50-51
    3.2 菌株 JG1 抑菌活性组分分析  51-55
    3.3 不同培养时间对菌株 JG1 胞外抑菌蛋白的影响  55-56
  4 讨论  56-57
第三章 金丽假交替单胞菌 JG1 胞外抑菌蛋白的分离纯化、序列分析及重组表达研究  57-81
  1 实验材料及仪器  57-59
    1.1 菌株及质粒  57-59
    1.2 培养基  59
    1.3 主要仪器  59
  2 实验方法  59-66
    2.1 菌株 JG1 胞外产物的提取  59
    2.2 分步硫酸铵沉淀法对菌株 JG1 的胞外蛋白的初步纯化  59-60
      2.2.1 分步硫酸铵沉淀法  59-60
      2.2.2 Bradford 法测定蛋白含量  60
      2.2.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测  60
      2.2.4 各部分胞外产物抑菌活性检测  60
    2.3 菌株 JG1 胞外蛋白的 SDS-PAGE 及胶内活性检测  60-61
      2.3.1 胞外蛋白的 SDS-PAGE 检测  60-61
      2.3.2 胶内活性检测  61
    2.4 电洗脱法对菌株 JG1 抑菌蛋白的纯化及活性检测  61-63
      2.4.1 电洗脱仪 Model 422 Electro-Eluter (Bio-Rad)的组装  61-62
      2.4.2 电洗脱法对菌株 JG1 抑菌蛋白的纯化  62-63
      2.4.3 纯化后抑菌蛋白的 SDS-PAGE 检测及胶内活性检测  63
    2.5 对菌株 JG1 抑菌蛋白的 De novo 测序  63
    2.6 菌株 JG1 抑菌蛋白的序列分析  63-64
    2.7 菌株 JG1 抑菌蛋白在大肠杆菌 BL21 中的重组表达  64-65
      2.7.1 菌株 JG1 抑菌蛋白的克隆及 pET 系列表达质粒的构建  64
      2.7.2 表达质粒 pBAD/Myc-HisB 及 pRSFDuet-1 对抑菌蛋白 PfaP 的重组表达  64-65
      2.7.3 菌株 JG1 抑菌蛋白的诱导表达、活性检测及 SDS-PAGE  65
      2.7.4 重组表达抑菌蛋白的纯化、活性检测及 SDS-PAGE  65
    2.8 过氧化氢酶对菌株 JG1 抑菌蛋白活性的影响  65-66
  3 实验结果  66-77
    3.1 分步硫酸铵沉淀法对菌株 JG1 的胞外蛋白的初步纯化  66-67
    3.2 菌株 JG1 胞外蛋白的 SDS-PAGE 及胶内活性检测  67-68
    3.3 纯化后抑菌蛋白的 SDS-PAGE 及胶内活性检测  68-69
    3.4 抑菌蛋白的 De novo 测序及序列分析  69-72
    3.5 菌株 JG1 抑菌蛋白在大肠杆菌 BL21 中的重组表达  72-76
      3.5.1 抑菌蛋白 PfaP 的重组表达及活性检测  72-75
      3.5.2 重组表达的抑菌蛋白的纯化、活性检测及 SDS-PAGE  75-76
    3.6 过氧化氢酶对菌株 JG1 抑菌蛋白活性的影响  76-77
  4 讨论  77-81
    4.1 抑菌蛋白 PfaP 的 L-氨基酸氧化酶活性预测  77-79
    4.2 抑菌蛋白 PfaP 的外源重组表达  79-81
第四章 金丽假交替单胞菌 JG1 抑菌小分子化合物的分离纯化及性质研究  81-93
  1 实验材料及仪器  81-82
    1.1 菌株  81
    1.2 培养基  81-82
    1.3 主要仪器  82
  2 实验方法  82-85
    2.1 菌株 JG1 发酵液的制备及乙酸乙酯萃取法对小分子化合物的粗提  82
    2.2 小分子化合物的分离纯化及结构测定  82-83
    2.3 小分子化合物抑菌活性的测定  83-84
      2.3.1 TLC 板生物自显影法  83
      2.3.2 微量液体法  83-84
      2.3.3 TLC 板生物自显影法对化合物 1-5 抑菌谱的测定  84
    2.4 小分子化合物最小抑菌浓度（MIC）的测定  84-85
      2.4.1 纸片法  84
      2.4.2 微量稀释法  84-85
  3 实验结果  85-90
    3.1 抑菌小分子化合物的结构测定  85-87
      3.1.1 初步分离的 12 组分的抑菌活性检测  85
      3.1.2 十种小分子化合物的结构  85-87
    3.2 抑菌小分子化合物的活性检测  87-90
      3.2.1 小分子化合物抑菌活性检测  87
      3.2.2 微量液体法对化合物 1-5 抑菌活性的检测  87-89
      3.2.3 化合物 1-5 抑菌谱的测定  89-90
    3.3 小分子化合物最小抑菌浓度的测定  90
      3.3.1 纸片法对小分子化合物最小抑菌浓度的测定  90
      3.3.2 微量稀释法对小分子化合物最小抑菌浓度的测定  90
  4 讨论  90-93
第五章 金丽假交替单胞菌 JG1 全基因组测序及分析  93-116
  1 实验材料及仪器  93-94
    1.1 菌株  93-94
    1.2 培养基  94
    1.3 主要仪器  94
  2 实验方法  94-97
    2.1 菌株 JG1 基因组 DNA 的提取  94
    2.2 菌株 JG1 基因组 DNA 的质量检测  94
    2.3 菌株 JG1 基因组测序、组装及基因功能预测  94-95
    2.4 菌株 JG1 基因组序列分析  95
    2.5 菌株 JG1 密度感应系统信号分子（AHL）的检测  95-96
      2.5.1 双层平板法  95-96
      2.5.2 琼脂扩散法  96
    2.6 菌株 JG1 密度感应淬灭活性的检测  96-97
      2.6.1 液体法  96-97
      2.6.2 平板法  97
  3 实验结果与讨论  97-114
    3.1 菌株 JG1 基因组 DNA 的提取及检测  97-98
    3.2 菌株 JG1 基因组的一般特征及与其他假交替单胞菌基因组的比较  98-104
    3.3 参与抑菌物质生物合成的相关基因  104-107
      3.3.1 抑菌蛋白  104
      3.3.2 对羟基苯甲酸的生物合成  104
      3.3.3 反式桂皮酸的生物合成  104-105
      3.3.4 6-溴吲哚-3-乙酸的生物合成  105-106
      3.3.5 几丁质酶  106-107
      3.3.6 次级代谢产物相关基因  107
    3.4 菌株 JG1 密度感应系统及淬灭活性  107-110
      3.4.1 菌株 JG1 密度感应信号分子检测  107-109
      3.4.2 密度感应系统相关基因  109
      3.4.3 菌株 JG1 的密度感应淬灭活性及相关基因  109-110
    3.5 磷的获取及环境压力的适应  110-111
      3.5.1 磷的获取相关基因  110
      3.5.2 适应环境压力的相关基因  110-111
    3.6 运动性及分泌特征  111-114
      3.6.1 运动性相关基因  111-113
      3.6.2 分泌特性  113-114
    3.7 抗药性及转运系统  114
  4 小结  114-116
第六章 结论  116-119
  1 全文总结  116-118
  2 主要创新点  118-119
参考文献  119-131
附录 溶液配方  131-133
致谢  133-134
个人简历  134
已发表的学术成果  134-136

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