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蓝细菌光敏色素结构域体内重组及光化学性质研究

作　者: 刘冰冰
导　师: 赵开弘
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 蓝细菌光敏色素 体内重组 GAF结构域 可逆光转换 蓝/绿光受体
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


植物光敏色素是一种光受体,含有线性四吡咯生色团的水溶性蛋白质,具有可逆光转换效应。近年来研究发现光敏色素也存在于细菌和真菌中。蓝细菌光敏色素是一类共价结合藻胆色素发色团的光谱多变的光受体家族,它们的光谱变化几乎覆盖了近紫外/可见光区,与植物光敏色素有较远的亲缘关系,且只存在于蓝细菌内。蓝细菌光敏色素还可能涉及到昼夜节律和细胞聚集的光感应重新组合。研究表明,单独的GAF结构域与生成藻胆色素的基因在大肠杆菌中共表达,可获得与蓝细菌光敏色素全蛋白的光化学性质相似的色素蛋白。Thermosynechococcus elongatus BP-1中含有蓝细菌光敏色素数量比较少,且它们是热稳定的,通过蛋白质序列同源性比对分析,在它里面找到了与已知的Pb/Pg型蓝细菌光敏色素TePixJ和TeTlr0924同源的4个基因tll0899、tlr0911、tlr1215和tlr1999。通过分子克隆技术把它们的GAF结构域分别构建在pET30a（+）表达载体上,与质粒pACYCDuet-hol-pcyA在大肠杆菌体内重组生成重组蛋白。实验结果表明,Tll0899-GAF具有光化学活性可共价结合藻蓝胆素（PCB）,Tlr0911-GAF存在蓝光吸收态Pb406nm和绿光吸收态Pg527nm之间的可逆光转换,Tlr1999-GAF则存在蓝光吸收态Pb417nm（?）青光吸收态Pt496nm之间的可逆光转换,它们均共价结合两种藻胆色素,即藻紫胆素（PVB）和藻蓝胆素（PCB）,Tlr0911-GAF和Tlr1999-GAF均在蓝光区和绿光区有吸收可称之为蓝/绿光受体。该实验表明Tlr0911（?）口Tlr1999的GAF结构域可能具有3个活性功能,即为自催化裂合酶活性,自催化异构酶活性,光致异构化活性。而Tlrl215-GAF1和Tlr1215-GAF2不能自发结合藻胆色素,不具有光化学活性。在对Synechococcus sp.CC9311中仅有的两个推测的蓝细菌光敏色素Sync0012和Sync1604研究中,将它们的GAF结构域分别构建在pET30a（+）表达载体上,单独诱导表达或与质粒pACYCDuet-hol-pcyA在大肠杆菌体内重组后表达,得到水溶性较低的蛋白质,通过加入尿素促溶,经过实验验证,Sync0012-GAF和Sync1604-GAF不能与藻胆色素共价结合,但是它们可能与核黄素等大肠杆菌体内的色素结合,这还需要进一步的研究。根据Nostoc sp. PCC7120中所有的GAF结构域氨基酸序列信息进行蛋白质聚类分析,利用生物软件Clustal X1.83和MEGA version5.0做出Nostoc sp. PCC7120中GAF结构域进化树示意图,发现一个含有保守性的DXCF基序的光受体分支,以及其它一些同源性较高的光受体分支。利用分子生物学技术构建GAF结构域的表达质粒,分别将各种表达质粒与催化藻蓝色素生物合成的质粒pACYCDuet-hol-pcyA同时转入大肠杆菌BL21体内重组,诱导表达生成重组蛋白。发现2个具有可逆光转换效应的含DXCF基序的蓝细菌光敏色素A111688和Alr1966,All1688-GAF主要结合PCB,其可逆光转换效应比较微弱,它的Pg态和Pb态的吸收光谱具有重叠现象；Alr1966-GAF2共价结合PVB和PCB,有3种光状态：Pg态、中间态和Pb态,它具有顺序光可逆循环。另一个由All4978-GAF、All7016-GAF和Alr7522-GAF组成的光受体分支,其中Alr7522-GAF不具有光化学活性,而其余2个具有性质相似的光化学活性,但是不具备可逆光转换效应,根据其吸收光谱推测它们结合的色素可能为血红素。通过蛋白质序列同源性和相似性比对分析,发现Synechocystis sp. PCC6803中sll1888、sll1228、sll1124基因编码的蛋白质分别与Slr1393、Sl10041、UirS（基因为slr1212）具有同源性。利用分子生物学技术构建这3个基因GAF结构域的表达质粒,分别将表达质粒与质粒pACYCDuet-ho1-pcyA同时转入大肠杆菌BL21中共表达生成重组蛋白,实验结果显示,它们并不能结合藻胆色素,不具有光化学活性。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-13
缩略词表  13-14
1 序言  14-26
  1.1 蓝细菌的概述  14-15
  1.2 植物光敏色素  15-17
    1.2.1 植物光敏色素的概述  15-16
    1.2.2 植物光敏色素的结构组成  16
    1.2.3 植物光敏色素的生理功能  16-17
  1.3 蓝细菌光敏色素  17-25
    1.3.1 蓝细菌光敏色素的发现  17-18
    1.3.2 蓝细菌光敏色素的结构和独特特征  18-19
    1.3.3 蓝细菌光敏色素的生物合成  19-22
    1.3.4 蓝细菌光敏色素的色素结合位点  22-23
    1.3.5 蓝细菌光敏色素的可逆光转换效应机理  23-25
  1.4 课题的研究目的与意义  25-26
2 Thermosynechococcus elongatus BP-1中几个蓝细菌光敏色素结构域体内重组及光化学性质的研究  26-45
  2.1 序言  26-27
  2.2 材料与仪器  27-30
    2.2.1 菌种与质粒  27
    2.2.2 培养基及试剂  27-29
    2.2.3 主要仪器  29-30
  2.3 实验方法  30-35
    2.3.1 结构域组成分析  30
    2.3.2 表达质粒的构建  30-32
    2.3.3 重组菌株的构建和共表达  32
    2.3.4 重组蛋白的超声破碎与提纯  32-33
    2.3.5 透析袋的使用及保存  33
    2.3.6 SDS-PAGE和锌荧光实验  33-34
    2.3.7 光谱分析  34
    2.3.8 可逆光转换效应的检测  34
    2.3.9 色素蛋白的变性实验  34-35
  2.4 实验结果及分析  35-43
    2.4.1 T.elongatus BP-1中CBCRs GAF结构域氨基酸序列的同源性比对  35-36
    2.4.2 T.elongatus BP-1中CBCRs的结构域组成分析  36
    2.4.3 表达质粒构建和重组菌株表达的鉴定  36-37
    2.4.4 光化学性质分析  37-42
    2.4.5 色素蛋白的SDS-PAGE和锌荧光实验结果  42-43
    2.4.6 Tlr0911-GAF和Tlr1999-GAF中结合PVB与PCB的比值  43
  2.5 小结与讨论  43-45
3 Synechococcus sp.CC9311中蓝细菌光敏色素结构域体内重组和光化学性质的研究  45-51
  3.1 序言  45
  3.2 材料与仪器  45-46
    3.2.1 菌种与质粒  45-46
    3.2.2 培养基及试剂  46
    3.2.3 主要仪器  46
  3.3 实验方法  46-47
    3.3.1 结构域构成分析  46
    3.3.2 引物的设计与合成  46
    3.3.3 表达质粒的构建  46-47
    3.3.4 重组菌株的构建和蛋白质的提纯  47
    3.3.5 光谱分析  47
  3.4 实验结果及分析  47-50
    3.4.1 sync_0012和sync_1604的结构域组成分析  47
    3.4.2 表达质粒的构建及鉴定  47-48
    3.4.3 重组菌株的表达和重组蛋白的鉴定  48-49
    3.4.4 Sync_0012-GAF和Sync_1604-GAF的光化学性质分析  49-50
    3.4.5 SYNC 0012-GAF'和SYNC_1604-GAF的光化学性质分析  50
  3.5 小结与讨论  50-51
4 Nostoc sp.PCC 7120中几个分支的蓝细菌光敏色素结构域体内重组和光化学性质的研究  51-65
  4.1 序言  51
  4.2 材料与仪器  51-52
    4.2.1 菌种与质粒  51-52
    4.2.2 培养基及试剂  52
    4.2.3 主要仪器  52
  4.3 实验方法  52-54
    4.3.1 Nostoc sp.PCC 7120中GAF结构域的聚类分析  52
    4.3.2 结构域组成分析  52
    4.3.3 引物的设计与合成  52
    4.3.4 表达质粒的构建  52-54
    4.3.5 重组菌株的构建和重组蛋白的提纯  54
    4.3.6 光谱分析  54
  4.4 实验结果及分析  54-63
    4.4.1 Nostoc sp.PCC 7120中CBCRs GAF结构域的聚类分析  54-55
    4.4.2 Nostoc sp.PCC 7120中CBCRs的结构域组成分析  55-56
    4.4.3 表达质粒的构建及鉴定  56-58
    4.4.4 光化学性质分析  58-63
  4.5 小结与讨论  63-65
5 Synechocystis sp.PCC 6803中几个蓝细菌光敏色素结构域体内重组和光化学性质的研究  65-71
  5.1 序言  65
  5.2 材料与仪器  65-66
    5.2.1 菌种与质粒  65
    5.2.2 培养基及试剂  65-66
    5.2.3 主要仪器  66
  5.3 实验方法  66-67
    5.3.1 结构域构成分析  66
    5.3.2 引物的设计与合成  66
    5.3.3 表达质粒的构建  66-67
    5.3.4 重组菌株的构建和重组蛋白的提纯  67
    5.3.5 光谱分析  67
  5.4 实验结果及分析  67-70
    5.4.1 同源性分析  67-69
    5.4.2 结构域组成分析  69
    5.4.3 表达质粒的构建及鉴定  69-70
    5.4.4 重组蛋白的光化学性质分析  70
  5.5 小结与讨论  70-71
参考文献  71-78
附录Ⅰ  78-79
附录Ⅱ 攻读硕士学位期间发表的学术论文  79-80
致谢  80

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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