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丛枝菌根共生体磷信号转运受体的发现及其分子机制的研究

作 者: 谢贤安
导 师: 赵斌
学 校: 华中农业大学
专 业: 微生物学
关键词: 丛枝菌根 紫云英 玻璃状巨大球囊霉菌 磷转运蛋白 转运受体
分类号: Q93
类 型: 博士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


丛枝菌根是球囊菌门的从枝菌根真菌与高等维管束植物根系建立的互惠共生体,丛枝菌根是自然界中分布最为广泛的共生体,80%以上的陆生维管束植物能与菌根真菌形成植物内共生体。丛枝菌根真菌为宿主植物提供无机矿质营养,主要是磷素与氮素,促进植物的生长和矿质营养的吸收利用。反过来,植物通过光合作用为AM真菌提供碳源,使其菌丝正常生长发育并完全成生适史。AM真菌介导的磷吸收途径第一步是靠真菌细胞膜上Pi转运蛋白将土壤中的无机磷酸盐转运到根外菌丝中,在真菌与植物的共生界面又依靠AM特异性的植物Pi转运蛋白将质外体空间的游离态磷酸盐转运到皮层细胞。然而到目前为止,这些代谢途径中的许多科学问题还没有完全被理解,甚至对有些问题尚不清楚。Pi作为营养物质被AM菌根途径吸收转运,同时Pi又作为一种信号来调控AM共生体系的建立与发育,Pi信号调控AM共生体系的分子机理还是不明确。在本文中,以AM真菌Gigaspora margarita和紫云英(Astragalua sinicus)为材料,通过分子生物学,生物化学,反向遗传学,细胞生物学以及生理学等方法详细深入探讨了AM共生体系中磷转运基因的功能及其作用的分子机制。1.发现了G margarita (BEG34)中存在一个高亲和力磷转运系统,分离出该系统关键调控基因GigmPT,属于高亲和力无机磷酸盐转运基因。GigmPT是MFS超家族转运体,编码一个膜整合蛋白,由12个疏水的跨膜结构域组成,包括6个N端的跨膜区与6个C端的跨膜区,第六个和第七个跨膜区之间存在一个大中央亲水环,氨基酸N端和c端均在细胞质侧。在AM真菌中调控一个类似酵母PHO调控系统的途径。从A. sinicus中分离到类似的AM特异性AsPT1与AsPT4磷转运蛋白,调控AM共生界面磷转运。2.分离到的这些磷转运基因在共生时期诱导表达,尤其是在丛枝细胞中大量表达,同时受Pi抑制表达。宿主根组织碳源能够激发GigmPT基因的表达,GigmPT基因的活性同样影响着AM共生体的碳转运。3.反向遗传学研究结果表明GigmPT是AM共生体系的必需基因,GigmPT的功能直接影响AM真菌G margarita菌丝以及丛枝的生长与发育,维持真菌在植物体内持续生长是必不可少的。该基因失活后阻断共生Pi转运,且在丛枝细胞积累大量多聚磷酸盐。4.利用生物化学方法研究该基因发现其还具有受体功能,即是一个转运受体,调控PKA信号途径;利用SCAM与突变分析找到了转运受体GigmPT的磷酸盐结合位点,并发现该转运体利用同一个位点进行转运与信号识别。转运受体GigmPT的信号激活需要发生特异的构象变化。5.研究还发现在AM共生体中存在第二类AM特异性磷转运基因AsPT1,与第一类AsPT4基因一起非冗余性调节AM共生体系,尤其调节丛枝的发育。还发现AsPT4对AM途径磷转运起主要作用,而AsPT1不是共生磷转运必须基因,可能编码一个非转运型转运受体,调控丛枝界面Pi与营养代谢平衡。研究还发现AsPT4在非公生时期植物根尖以及分生组织中表达,在共生时期却只在含丛枝的细胞中表达,该基因调节侧根生长发育。6.通过本文研究,得出一个重要的假说:在AM共生体系中存在一类磷素营养转运受体,同时调控PHO与PKA途径,对AM共生体的磷代谢与营养平衡起至关重要的作用。推测在AM共生体中这是一个普遍规律,绝大多数营养转运子(包括C,N和P等)可能都获得了受体功能,起着信号转导功能,调节AM真菌在植物体内正常生长发育。还提出了传统的化学信号受体最早是由营养转运体进化而来的模型。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-12
缩略语表  12-14
1 前言  14-48
  1.1 丛枝菌根与丛枝菌根真菌  14-16
    1.1.1 丛枝菌根  14-15
    1.1.2 丛枝菌根真菌  15-16
  1.2 AM共生体的发育与共生信号  16-22
    1.2.1 AM共生体的发育  16-18
    1.2.2 AM共生信号  18-22
  1.3 AM共生体对磷信号的感知与反应  22-25
    1.3.1 磷酸盐作为一种信号系统性抑制AM共生体发育  22-24
    1.3.2 磷酸盐抑制丛枝菌根化相关的功能基因  24-25
  1.4 菌根途径与共生磷转运  25-31
    1.4.1 菌根途径  25-26
    1.4.2 互惠回报稳定合作的AM共生体系  26-28
    1.4.3 AM共生磷转运  28-29
    1.4.4 AM共生磷转运信号事件  29-31
  1.5 营养信号转运受体  31-36
    1.5.1 磷酸盐转运受体  32-33
    1.5.2 葡萄糖转运受体  33
    1.5.3 氨基酸转运受体  33-34
    1.5.4 铵盐与硝酸盐转运受体  34-36
    1.5.5 受体的进化来源于转运体  36
  1.6 AM共生体磷信号转运受体存在的证据  36-38
  1.7 AM特异性磷转运蛋白的进化保守性  38-41
  1.8 细胞自发与扩散信号调控丛枝的发育  41-44
  1.9 研究目标与结论  44-47
    1.9.1 科学问题与研究目标  44-46
    1.9.2 结论与假说  46-47
  1.10 意义与展望  47-48
2 实验材料与方法  48-71
  2.1 AM真菌与植物材料及培养条件  48-49
  2.2 实验设计及培养条件  49-50
  2.3 分子生物学方法  50-65
  2.4 海藻糖酶活分析  65
  2.5 半胱氨酸代替趋近定位(SCAM)分析  65-66
  2.6 磷酸盐同位素吸收实验  66
    2.6.1 同位素吸收最佳pH实验  66
    2.6.2 放射性同位素标记测定吸收动力学特性  66
  2.7 同位素示踪实验  66-67
    2.7.1 AM途径磷吸收定量分析  66-67
    2.7.2 P含量测定及放射性磷酸盐的转运  67
  2.8 与超量表达与RNAi实验  67-68
    2.8.1 AsPT1基因在菌根组织中超量表达  67
    2.8.2 AsPT1与AsPT4 RNA干扰载体的构建  67-68
  2.9 宿主诱导基因沉默  68
    2.9.1 HIGS体系的建立  68
    2.9.2 RNA分析与siRNAs的检测  68
  2.10 PT基因启动子分离与截短实验  68-69
    2.10.1 AsPT1与AsPT4及AsPT5启动子UidA报告系统  68-69
    2.10.2 AsPT4启动子片段的截短缺失分析  69
    2.10.3 GUS酶活测定  69
  2.11 电泳迁移率分析(EMSA)  69-71
  2.12 酵母及洋葱表皮细胞中GFP融合蛋白的亚细胞定位  71
3 结果与分析  71-97
  3.1 GigmPT基因编码一个磷酸盐转运蛋白  71
  3.2 GigmPT表达依赖磷水平和AM共生状态  71-73
  3.3 菌根内碳源可以激发GigmPT基因的表达  73
  3.4 GigmPT编码一个高亲和力磷酸盐转运子  73-75
  3.5 GigmPT是提高AM共生体系Pi含量与生长的必需转运体  75-78
  3.6 GigmPT功能的缺失抑制碳源转运  78
  3.7 GigmPT功能的缺失影响AM真菌的形态与根内外菌丝的生长  78-80
  3.8 GigmPT的失活导致丛枝积累多聚磷酸盐  80-81
  3.9 GigmPT是保持丛枝寿命与维持AM真菌发育的必需转运体  81-82
  3.10 GigmPT是一个转运受体  82-83
  3.11 Gly3P对PKA信号的激活作用需要GigmPT  83-84
  3.12 激动剂Gly3P与非激动剂PAA竞争性抑制GigmPT  84
  3.13 SCAM鉴定A~(146)与Val~(357)残基暴露于磷酸盐结合位点  84-86
  3.14 新型菌根特异性AsPT1与PHT1转运蛋白的特征  86-87
  3.15 Pht1的表达依靠磷的水平和AM共生状态  87-89
  3.16 Pht1转运蛋白的亚细胞定位和组织定位  89-90
  3.17 顺式作用元件调控AM特异性AsPT4基因的表达  90-91
  3.18 AsPT1和Pht1家族在酵母中的功能分析  91-93
  3.19 AsPT1能促进AM共生体的发育  93-95
  3.20 AsPT1和AsPT4是AM发育的必需基因  95
  3.21 AsPT1或AsPT4基因的沉默导致丛枝过早死亡  95
  3.22 AsPT4是AM途径磷转运的主要贡献者  95-97
4 讨论  97-101
  4.1 GigmPT属于高亲和力磷转运系统  97
  4.2 GigmPT对AM共生体发育是必需的  97
  4.3 AM共生体系中磷信号转运受体  97-99
    4.3.1 通过GigmPT产生的信号不需要完成转运循环  97-98
    4.3.2 GigmPT产生的信号需要特异的构象变化  98
    4.3.3 GagmPT利用同一个磷酸盐结合位点进行转运和信号转导  98-99
  4.4 AsPT4旁系同源的AsPT1是一个新的AM特异的磷酸盐转运子  99
  4.5 AsPT1和AsPT4是AM共生的必需蛋白  99-100
  4.6 AsPT1可能编码一个转运受体在丛枝界面调节Pi平衡  100-101
参考文献  101-117
附录  117-132
发表文章  132-133
致谢  133

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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