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橙色粘球菌type Ⅳ pilus蛋白间的相互作用暨Na~+/H~+ antiporter和外膜蛋白影响盐环境下多细胞行为的遗传分析

作　者: 李成云
导　师: 李越中
学　校: 山东大学
专　业: 微生物学
关键词: 黄色粘球菌(Myxococcus xanthus) Myxococcus fulvus HW-1 Type Ⅳpili 运动发育
分类号: Q936
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

粘细菌是δ-分支变形菌门革兰氏阴性细菌,细胞的多细胞行为是通过滑动运动组织和驱动细胞在固体界面完成的。利用Type IV pilus(T4P)作为运动马达在固体界面上驱动细胞进行细胞群体运动(1)。T4P介导的运动的机制是与单个细胞运动相对独立并且利用完全不同的运动机制。T4P定位于Myxococcus xanthus细胞两极中的极性端。Myxococcus xanthus的群体(S)运动,Y-变形菌门Pseudomonas aeruginosa和p-变形菌门Neisseria meningitides, Neisseria gonorrhoeae (2,3)的twitching运动是通过T4P产生的收缩力推动细胞向前运动的。M. xanthus的Type Ⅳ pilus (T4P)是目前已知的最强的生物马达,单根pilus能够产生超过100pN的力,这个力足够推动细胞向前运动。Myxococcus xanthus的群体(S)运动另外还需要胞外多糖(EPS),因为胞外多糖缺失突变株中是没有S运动的。目前群体运动的模型是,当T4P伸出细胞的极性末端与胞外多糖(EPS)相互连接时,极性端的T4P收缩从而使得细胞向前运动。这里所说的胞外多糖是指细胞表面的胞外多糖或者是滑动介质表面的胞外多糖。目前,许多T4P的关键组分已经被鉴定出来,T4P的复合物也不断的被发现,例如,P. aeruginosa和Neisseria是中由PilM, PilN, PilO和PilP形成的内膜复合物。对于M. xanthus T4P蛋白是以何种形式形成复合物驱动群体运动仍然是一个有待研究的领域。Myxococcus xanthus提供了一个很好的研究T4P的模型,不仅是因为群体滑动运动是由T4P所驱动的,而且T4P在胞外多糖(EPS)的产生中也发挥着重要的调节作用。在本论文中,粘细菌T4P蛋白通过遗传学、酵母双杂交和细菌双杂交等的手段进行研究。实验前期发现的PilB点突变,能够在没有pili的情况下恢复部分的EPS产生。PilB点突变恢复胞外多糖实验来分析抑制子能否在pil基因的缺失突变株中抑制胞外多糖缺失,结果暗示着T4P可能存在着整合的T4P复合物结构,这个可能的复合物结构包括外膜蛋白PilQ蛋白,内膜穿膜蛋白PilN蛋白,PilO蛋白和PilC蛋白,以及锚定在内膜的脂蛋白PilP。细胞质的PilM和PilB蛋白可能也与复合物以某种相互作用。这种结构是能够连接内膜,周质空间和外膜的。进一步的分析发现,这种结构可以存在在pilus缺失的情况下。系统的酵母双杂交对于核心的关键T4P蛋白组分之间的直接的相互作用进行了分析,将10个关键组分的全序列或者是部分序列分别与酵母双杂交的激活结构域或者结合结构域的两个载体连接构建了一系列的融合质粒。利用酵母双杂交系统的mating方法对这一系列的关键组分潜在的相互作用进行了大规模的筛选。酵母双杂交结果提供了直接的相互作用证据在内膜和外膜蛋白面向细胞周质空间的区域的相互作用。发现了M. xanthus Pil蛋白间存在的相互作用：1)PilB-PilB,同时也发现了PilB的N末端与C末端的相互作用。以及PilB的Walker A和Walker B中点突变对于PilB的N末端与C末端的相互作用的负影响等。2)我们发现了PilC-PilC之间的相互作用,值得注意的是,PilC的相互作用是具有其自身的特异性,简单的PilC的N末端与C末端是不存在相互作用的。我们利用一个linker将N末端与C末端连接(不包含穿膜区域),发现PilCNlinkerCC与PilCNlinkerCC具有相互作用,另外,PilCNlinkerCC与PilCClinkerCC同样具有相互作用,结果暗示着PilC的相互作用需要N末端与C末端的同时存在。3)PilQ-PilQ, PilP-PilQ, PilP-PilO和PilO-PilN蛋白间的相互作用。外膜蛋白PilQ蛋白,内膜穿膜蛋白PilN蛋白,PilO蛋白,以及锚定在内膜的脂蛋白PilP。这四个蛋白的相互作用使得外膜PilQ蛋白能够与内膜的T4P蛋白进行信号传导有了可能。鉴于变形菌门中多种细菌间均存在着T4P的复合物结构,我们进一步检测了非变形菌门中的Thermus thermophiles细菌T4P蛋白间是否存在着T4P结构复合物。通过酵母双杂交实验分析我们获得了PilQ-PilQ, PilW-PilQ, PilW-PilO和PilO-PilN蛋白间的相互作用。值得注意的是,PilW与M.xanthus中PilP蛋白间不存在任何的相似性。同时,PilW-PilQ与M. xanthus中PilP-PilQ蛋白间的相互作用的作用的位点是不同的,这说明相似的蛋白间的相互作用存在T4P在非变形菌门中存在,尽管在Thermus thermophiles和Myxococcus xanthus PilQ蛋白存在着显著的序列差异性,暗示着不同的菌株间仍然存在着各自的特异性,相互作用的位点因菌株不同而有所不同。Myxococcus xanthus对于T4P的结构复合物存在着许多模型,本论文是第一次给出直接的证据证明T4P蛋白自身和蛋白间存在着相互作用。变细菌门和非变形菌们的细菌中,在没有pilus存在的前提下仍然存在着从内膜穿过周质空间到外膜的整合的复合物结构,这种复合物在EPS产生中的调节支路中的作用解释了复合物存在的原因。粘细菌大规模的细胞协同作用展现复杂的社会行为。成千上万的细胞应答贫瘠环境通过滑动运动协同运动形成子实体,在这个过程当中营养细胞分化形成环境抗逆性孢子。粘细菌的多细胞行为也包括swarming, rippling和捕食(4)。M.xanthus细胞是不能够在液体中运动的,这种陆生细菌能够在固体的介质表面进行滑动运动。当这些细胞在液体环境中静置培养时,在培养摇瓶的壁上形成生物膜。将营养培养基替换成贫瘠培养基时,细胞聚集,隆起并形成子实体,M. xanthus细胞是通过胞内外的信号调控过程完成多细胞行为和生孢的过程。细胞同步的协同运动完成了预先调控的发育过程。实验室在90年代中期发现的一株能够耐受海水的粘细菌,Myxococcus fulvus HW-1(ATCC BAA-855)与典型的陆生菌株的社会学行为有着一定的不同。在低浓度海水条件下,其与典型的陆生菌DK1622表现类似的生活模式：细胞密度依赖性,固体贫瘠培养基上细胞聚集形成典型的子实体,子实体内的营养细胞分化形成孢子。但随着海水浓度的提高,HW-1的生长模式变化,贫瘠培养基中营养细胞不经过子实体的形成,直接形成粘孢子(5)。HW-1与M.xanthus的类似的生活模式使得我们可以对比分析来对HW-1进行深入的了解,以及HW-1相对M. xanthus差异明显的生活模式转变,这种独特的转变机制的使得HW-1可以作为研究海洋粘细菌的模式菌株。实验室为研究HW-1的这种适应性进化的机制,实验室前期利用随机转座质粒对HW-1进行随机突变获得的300多株多细胞行为和盐应答异常的突变株。其中存在着一株突变株引起了我们的兴趣,我们命名为YLH0402。对突变株进行了社会学行为的分析发现,YLH0402突变株导致菌株由聚团生长转变为分散生长,并且通过钙荧光白染色实验发现,分散生长的原因是由于其胞外基质物质的急剧减少所导致的。而贫瘠条件下的多细胞子实体结构形成能力丧失,耐盐能力也有明显的降低。通过Southern blot和质粒自营救实验我们确认的唯一的插入位点在一个Na+/H+antiporter基因。生物信息学分析发现,插入基因与M. xanthus中相应的同源基因以及上下游基因存在着很高的同源性。在M.xanthus中相应基因的插入失活显示着子实体形成的延迟和异常,生孢能力也有所降低。半定量的RT-PCR实验显示M. xanthus中插入基因与其临近的共七个基因是共转录的。这个基因簇内的基因的逐个敲除对于社会性行为并没有显著的降低,整个基因簇的敲除显示着生长的严重延迟,子实体形成异常,形成的孢子数目略有降低但孢子萌发率则显著降低,暗示着形成的孢子存在着严重的缺陷。实验结果显示着这个基因簇在维持耐盐能力和多细胞子实体结构存在着重要的作用,暗示这个基因簇可能在HW-1环境改变导致的适应机制的转换上发挥着重要的作用。实验室前期微阵列技术获得的在海水和淡水条件下HW-1中表达差异的外膜蛋白,我们对这些表达差异的外膜蛋白进行了进一步的分析,这对我们在宏观上理解HW-1的环境适应性机制的转化机制提供了可能。HW-1中表达差异蛋白与M. xanthus的同源基因的比对发现它们存在着高度的同源性。序列的高度同源性暗示着功能的相似性,在此基础上,我们利用基因敲除和插入的方法获得了M. xanthus中同源基因的基因缺失突变株或者是不同差异表达基因的双敲除突变株并进行了在海水和淡水条件下发育和运动等的性质分析,发现这些基因均在社会性行为中发挥着重要的作用,暗示着这些基因参与了HW-1细胞的环境适应性过程。微阵列技术在一定程度上弥补了HW-1遗传体系的不完善和随机转座带来的效率低下的缺点。综合前期微阵列和对这些显著差异表达的基因的分析发现,HW-1在海水中的调控可能是一种应激反应,也就是说,HW-1和M. xanthus的基因组水平的差异并不显著(HW-1测序完成后的数据支持),在海水环境和淡水环境转化时更倾向于利用不同的调控系统调控基因不同的表达方式来适应环境的改变,如Na+/H+antiporter基因簇在HW-1中的社会学行为能力更加显著。

全文目录

目录  4-9
TABLE OF CONTENTS  9-13
摘要  13-17
Abstract  17-24
第一章前言  24-44
  1.1 Myxococcus xanthus的多细胞行为综述  24-26
  1.2 Myxococcus xanthus在固体界面的滑动运动  26-34
    1.2.1 S运动系统  27-34
    1.2.2 A运动系统  34
  1.3 运动的调节系统  34-40
    1.3.1 Dif化感系统  34-36
    1.3.2 Frz化感系统  36-40
  1.4 海洋耐盐粘细菌(Myxococcus fulvus HW-1)的生存模式简述  40-42
    1.4.1 海洋耐盐粘细菌(Myxococcus fulvus HW-1)的社会性行为  40-41
    1.4.2 HW-1环境适应性进化生活模式转换的机制研究  41-42
  1.5 论文工作的开展思路以及研究内容  42-44
第二章橙色粘细菌遗传学方法检测type Ⅳ pilus PilM/N/O/P/Q复合物  44-66
  2.1 实验材料  45-50
    2.1.1 菌株及质粒  45-47
    2.1.2 培养基  47
    2.1.3 实验试剂及仪器耗材  47-50
  2.2 试验方法  50-55
    2.2.1 目的基因缺失载体的构建流程  50-51
    2.2.2 M. xanthus DK1622的电转化及突变株的筛选纯化  51-52
    2.2.3 目的基因的异源回补及示意图  52
    2.2.4 敲除突变株中的点突变置换  52-54
    2.2.5 运动能力分析  54
    2.2.6 胞外多糖分析  54-55
  2.3 结果与分析  55-64
    2.3.1 Myxococcus xanthus中Type Ⅳ pilus系统的作用  55
    2.3.2 pilM/N/O/P/Q敲除突变株回补表型  55-57
    2.3.3 pilB~*能够抑制pilG/H/I敲除突变株EPS缺失但不抑制pilM/N/O/P/Q/C敲除突变株EPS的缺失  57-64
  2.4 小章总结  64-66
第三章 Type Ⅳ pili蛋白间的直接相互作用  66-102
  3.1 实验材料  67-75
    3.1.1 菌株及质粒  67-72
    3.1.2 培养基  72-73
    3.1.3 实验试剂  73-75
    3.1.4 实验仪器及耗材  75
  3.2 试验方法  75-81
    3.2.1 酵母双杂和细菌双杂的质粒构建  75-76
    3.2.2 酵母转化或者共转化实验  76-78
    3.2.3 酵母mating方式获得二倍体细胞  78
    3.2.4 酵母转化子β-半乳糖苷酶活性分析(ONPG作为底物)  78-79
    3.2.5 酵母转化replica复制平板的方法  79
    3.2.6 酵母三杂交系统检测三个蛋白间的相互作用  79-80
    3.2.7 稀释点板试验  80
    3.2.8 细菌双杂交检测蛋白相互作用的步骤  80-81
  3.3 实验结果  81-100
    3.3.1 酵母双杂交检测M. xanthus Type Ⅳ pili蛋白间相互作用  81-89
    3.3.2 酵母三杂交检测M. xanthus Type Ⅳ pili蛋白可能相互作用  89-90
    3.3.3 M. xanthus PilC蛋白的相互作用检测  90-93
    3.3.4 细菌双杂交系统检测M. xanthus PilM,PilN,PilT和PilB蛋白相互作用  93-95
    3.3.5 Thermus thermophilus PilN/O/P/Q蛋白相互作用的发现和验证  95-100
  3.4 本章小结  100-102
第四章 Myxococcus fulvus HW-1和Myxococcus xanthus预测的Na~+/H~+ antiportercluster的功能分析  102-130
  4.1 实验材料  103-108
    4.1.1 菌株及质粒  103-104
    4.1.2 培养基  104-105
    4.1.3 实验试剂及仪器  105-108
  4.2 试验方法  108-113
    4.2.1 运动能力分析  108-109
    4.2.2 胞外多糖分析  109
    4.2.3 发育能力的分析  109-110
    4.2.4 细胞胞外多糖染料结合实验  110
    4.2.5 Southern杂交插入位点的验证  110-111
    4.2.6 RT-PCR实验  111
    4.2.7 Q-PCR实验  111-112
    4.2.8 敲除突变株的获得  112-113
    4.2.9 生长曲线的测定方法  113
    4.2.10 死活孢子染色实验  113
  4.3 实验结果和分析  113-127
    4.3.1 HW-1突变株社会学行为能力分析  113-116
    4.3.2 HW-1突变株插入位点的确定以及插入单一性的验证  116-117
    4.3.3 YLH0402插入转座子对插入基因以及上下游基因的影响  117-118
    4.3.4 YLH0402突变株发育阶段的LILAB_27425表达水平的初步分析  118-119
    4.3.5 DK1622中与HW-1的LILAB_27425同源基因的比较  119-120
    4.3.6 DK1622中MXAN_3848基因的插入失活突变株性质分析  120-121
    4.3.7 YL1001应答盐调控和社会学行为的分析  121-122
    4.3.8 YL1011社会学行为的变化  122-126
    4.3.9 MXAN_3844-MXAN_3850基因簇中单个基因敲除突变株社会学行为分析  126-127
  4.4 本章小结  127-130
第五章 M.fulvus HW-1中在淡水和海水条件下差异表达的外膜蛋白功能的初步探索  130-148
  5.1 实验材料  131-133
    5.1.1 菌株及质粒  131-133
    5.1.2 培养基  133
    5.1.3 实验试剂  133
    5.1.4 仪器设备及耗材  133
  5.2 实验方法  133-134
    5.2.1 目的基因缺失载体的构建流程  134
    5.2.2 DK1622黄色粘球菌的电转化和突变株筛选以及纯化  134
    5.2.3 子实体发育及生孢能力的分析  134
    5.2.4 运动能力的分析  134
  5.3 实验结果与分析  134-145
    5.3.1 芯片获得差异表达外膜蛋白的详细信息  134-135
    5.3.2 编码差异表达的外膜蛋白基因敲除载体构建以及验证  135-137
    5.3.3 敲除突变株的筛选,纯化与获得  137-138
    5.3.4 目的敲除突变株在不同盐浓度下子实体的发育和生孢能力分析  138-143
    5.3.5 目的敲除突变株在不同盐浓度条件下运动能力分析  143-144
    5.3.6 未成功获得敲除突变株的基因的插入失活分析  144-145
  5.4 本章小结  145-148
总结与展望  148-150
攻读博士期间发表的论文  150-152
致谢  152-154
参考文献  154-164
发表论文  164-174
学位论文评阅及答辩情况表  174

橙色粘球菌type Ⅳ pilus蛋白间的相互作用暨Na~+/H~+ antiporter和外膜蛋白影响盐环境下多细胞行为的遗传分析

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