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Zymomonas mobilis硫酸盐还原途径突变菌株的构建及其产H2S与产醇评价

作　者: 谈涛
导　师: 刘成；严明奕
学　校: 天津大学
专　业: 生物工程
关键词: 运动发酵单胞菌 同化硫酸盐还原 基因失活 H2S SO32- 甜高粱汁
分类号: TQ923
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


同化硫酸盐还原途径是微生物产生H2S的重要途径之一。虽然生物信息学研究结果已经显示运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）中存在这一途径，并预测了相关的基因，但是从实验水平上对该途径包括相关基因功能的验证、途径调控等还没有报道。同时，我们发现Z. mobilis ZM4菌株在甜高粱汁发酵过程中会产生刺激性的恶臭气体并被证实主要成分为H2S。因此，构建Z. mobilis同化硫酸盐还原途径相关基因缺失的突变菌株并研究其H2S的产生，对预测的Z. mobilis同化硫酸盐还原途径及相关基因功能的验证，甚至对Z. mobilis整个硫代谢的认识都具有重要的科学意义。本研究首先通过同源重组和FLP-FRT位点特异性重组的方法，成功构建了Z. mobilis同化硫酸盐还原途径ATP-硫酸化酶（cysN，cysD编码）失活的突变菌株cysND-cat、 cysND和亚硫酸还原酶（cysI，cysJ编码）失活的突变菌株cysIJ-cat、 cysIJ，以及这两个酶同时失活的突变菌株cysND-cat cysIJ、 cysND cysIJ-cat。研究对突变菌株在不同碳源（葡萄糖、蔗糖、果糖、甜高粱汁）培养基中的产H2S情况进行了考察，结果表明突变菌株在所测试条件下均不产生H2S，而ZM4对照菌株在除含果糖外的培养基中均有H2S生成；培养基中添加SO32-时，只有cysND-cat、 cysND菌株能够恢复产生H2S，而其它突变菌株均不能恢复H2S的产生，ZM4菌株仍能够产生H2S，说明cysND、cysIJ与H2S的产生相关，且CysND催化的反应位于同化硫酸盐还原代谢途径中的中间产物SO32-之前，而CysIJ所催化的反应位于SO32-之后。研究同时考察了摇瓶中cysND、 cysIJ以及cysND-cat cysIJ菌株分别在含10%葡萄糖和15%蔗糖的RM培养基及10%甜高粱汁中的生长和产醇情况，结果显示：（1）培养基中无SO32-添加时，三个突变菌株在两种RM培养基中的生长无明显差别且与ZM4接近（最大OD600均约为5）；含10%葡萄糖的RM培养基中突变菌株的最大产醇浓度分别为47.4g/L、48.3g/L和47.3g/L，均高于ZM4（46.7g/L）；含15%蔗糖的RM培养基中突变菌株的最大产醇浓度分别为46.4g/L、46.2g/L和46.3g/L，均低于ZM4（47.7g/L）；10%甜高粱汁中突变菌株的最大产醇浓度分别为35.0g/L、29.1g/L和34.7g/L，也均低于ZM4（46.2g/L）；（2）培养基中添加SO32-时，含10%葡萄糖的RM培养基中， cysND菌株的生长表现出24h的延滞期（ZM4延滞期为32h），最大OD600约为5（ZM4也约为5）与不加SO32-时的值接近，其最大产醇浓度为44.9g/L（ZM4为43.3g/L），而cysIJ及cysND-cat cysIJ菌株的整个生长过程均受到完全抑制，产醇几乎检测不到；含15%蔗糖的RM培养基中， cysND菌株的生长也表现出24h的延滞期（ZM4延滞期仍为32h），但最大OD600约为5.5与ZM4接近，其最大产醇浓度为48.8g/L低于ZM4（51.2g/L），而cysIJ以及cysND-cat cysIJ菌株的延滞期均约为40h，最大OD600为3～3.5，其最大产醇浓度分别为40.6g/L和48.6g/L。这些结果表明cysND和cysIJ的失活对突变菌株生长和产醇的不同影响在很大程度上取决于底物即碳源的种类。此外，突变菌株在发酵罐中以10%甜高粱汁为底物发酵时的的乙醇浓度、得率均低于ZM4，与前述摇瓶中的甜高粱汁发酵结果一致；而ZM4菌株在相同条件下的乙醇浓度、得率分别为47.41g/L和0.42，与已报道的Z. mobilis其它菌株的发酵结果相当，这也是首次利用ZM4菌株发酵甜高粱汁产醇的报道。

全文目录


中文摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
第一章 文献综述  10-33
  1.1 微生物 H_2S 代谢研究  10-15
    1.1.1 微生物硫代谢的重要性  10
    1.1.2 微生物产 H_2S 的研究  10-15
  1.2 Z. mobilis 同化硫酸盐还原途径产 H_2S 研究  15-19
    1.2.1 Z. mobilis 生物特性简介  15
    1.2.2 Z. mobilis 同化硫酸盐还原途径产 H_2S 的研究  15-19
  1.3 Z. mobilis 中的基因操作研究  19-26
    1.3.1 电转化方法研究  19-20
    1.3.2 基因重组方法研究  20-26
  1.4 Z. mobilis 的产醇研究  26-31
    1.4.1 葡萄糖为碳源的产醇研究  26-28
    1.4.2 果糖为碳源的产醇研究  28-29
    1.4.3 蔗糖为碳源的产醇研究  29-30
    1.4.4 甜高粱为原料的产醇研究  30-31
  1.5 本课题的研究目的、内容和技术路线  31-33
    1.5.1 研究目的  31
    1.5.2 研究内容  31-32
    1.5.3 技术路线  32-33
第二章 实验材料与方法  33-46
  2.1 实验材料  33-37
    2.1.1 菌株与质粒  33
    2.1.2 主要试剂  33-34
    2.1.3 主要仪器设备  34-35
    2.1.4 培养基的配制  35
    2.1.5 溶液的配制  35-37
    2.1.6 PCR 反应引物  37
  2.2 实验方法  37-46
    2.2.1 菌株的培养  37-38
    2.2.2 E. coli 中质粒的小量提取(SDS-碱裂解法)  38-39
    2.2.3 Z. mobilis 基因组的快速提取  39
    2.2.4 PCR 反应  39-40
    2.2.5 末端处理产生 A/T 端  40
    2.2.6 酶切反应  40
    2.2.7 电泳分析  40
    2.2.8 目的条带的回收  40-41
    2.2.9 平末端片段的脱磷处理  41
    2.2.10 连接反应  41
    2.2.11 感受态细胞的制备与转化  41-43
    2.2.12 Z. mobilis 转化子的鉴定  43
    2.2.13 Z. mobilis ZM4 突变菌株的生长曲线测定  43
    2.2.14 Z. mobilis ZM4 突变菌株的乙醇发酵评价  43-44
    2.2.15 Z. mobilis ZM4 突变菌株乙醇发酵过程中产 H_2S 分析  44-45
    2.2.16 Z. mobilis ZM4 突变菌株乙醇发酵过程中的 HPLC 分析  45-46
第三章 实验结果与讨论  46-73
  3.1 基因敲除整合质粒的构建  46-49
    3.1.1 质粒 pBR328-cysND-cat 的构建  46-48
    3.1.2 质粒 pBR328-cysIJ-cat 的构建  48-49
  3.2 Z. mobilis 的电转化及突变菌株的构建与筛选  49-58
    3.2.1 突变菌株 ZM4(cysND::FRT-cat-FRT)及 ZM4(cysND::FRT)的构建  50-54
    3.2.2 突变菌株 ZM4(cysIJ::FRT-cat-FRT)及 ZM4(cysIJ::FRT)的构建与筛选  54-55
    3.2.3 突变菌株 ZM4(cysND::FRT)(cysIJ::FRT-cat-FRT)及 ZM4(cysND::FRT-cat-FRT)(cysIJ::FRT)的构建与筛选  55-58
  3.3 突变菌株在含 2%葡萄糖 RM 培养基上的生长初步评价  58-59
  3.4 突变菌株在不同碳源培养基上产 H_2S 的初步检测  59-60
  3.5 甜高粱汁培养基中的产 H_2S 及发酵产醇评价  60-68
    3.5.1 10%甜高粱汁培养基中的产 H_2S 及发酵产醇情况  60-63
    3.5.2 10%甜高粱汁中添加 SO_3~(2-)时的 H_2S 产生情况  63-64
    3.5.3 发酵罐中甜高粱汁发酵时产生的挥发性硫化物及产醇分析  64-68
  3.6 含葡萄糖的 RM 培养基中产 H_2S、生长及发酵产醇评价  68-70
    3.6.1 含 10%葡萄糖的 RM 培养基中的 H_2S 产生情况  68-69
    3.6.2 含 10%葡萄糖的 RM 培养基中的生长考察  69
    3.6.3 含 10%葡萄糖的 RM 培养基中的发酵产醇情况  69-70
  3.7 含蔗糖的 RM 培养基中的产 H_2S、生长及发酵产醇评价  70-73
    3.7.1 含 15%蔗糖的 RM 培养基中的 H_2S 产生情况  70-71
    3.7.2 含 15%蔗糖的 RM 培养基中的生长考察  71-72
    3.7.3 含 15%蔗糖的 RM 培养基中的发酵产醇情况  72-73
第四章 结论与展望  73-75
  4.1 结论与主要创新点  73-74
  4.2 展望  74-75
参考文献  75-83
发表论文与科研情况说明  83-84
附录 本实验构建并用到的质粒图谱  84-87
致谢  87

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制高级醇及多元醇
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