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米曲霉产中性蛋白酶高产菌株的选育及其发酵条件优化

作　者: 袁艳玲
导　师: 杨生玉
学　校: 河南大学
专　业: 微生物学
关键词: 米曲霉中性蛋白酶诱变育种发酵优化
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

中性蛋白酶是一类最适作用pH为6.5～7.5的蛋白酶，它能将大分子蛋白质水解为肽类和游离氨基酸，被广泛应用于医药、食品和皮革等行业。本论文以米曲霉H0作为出发菌株，经紫外线、DES复合诱变，通过干酪素培养基筛选，得到一株中性蛋白酶高产菌株H2-5，其酶活力达到2158U/g，传代培养10代，菌株遗产稳定性能良好。确定了该菌株复合诱变的条件为：15W紫外灯照射，距离为25cm，照射时间为120s；DES诱变浓度为2％，诱变时间15min。通过复合诱变，筛选出一株产中性蛋白酶酶活力较高的菌株H2-5，其酶活较出发菌株提高了108.5%。研究了发酵培养条件对菌株的产酶影响：其中碳氮源、培养时间、培养温度、料水比及培养基初始pH值等对酶活影响较大；活性剂、无机盐对酶活也有影响。通过单因素实验确定了培养基组成为：碳源为麦麸、氮源为豆粕、碳氮比为4:1、料水比为5:4，确定了培养条件为：培养时间为84h、初始培养基pH值为7.5、活性剂为吐温-80、无机盐为KH₂PO₄和Na₂HPO₄、培养温度为30～32℃（前36h为32℃，后期温度为30℃），还确定了Ca²⁺对酶活的抑制作用。研究了以单因素实验结果为参照，利用响应面实验来确定多因素对米曲霉产中性蛋白酶的影响。通过响应面实验结果可知，发酵培养基的最适配方为：麦麸13.42g，豆粕3.45g，料水比1.29，中性蛋白酶产量为5561.76U/g，经过验证实验检测酶活力为5604U/g，发现模型能比较好的预测实际发酵产酶情况。研究了米曲霉高产菌株在大豆发酵中的应用，使其游离氨基酸量提高30%以上。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
1 前言  9-19
  1.1 米曲霉  9-11
    1.1.1 米曲霉在工业生产中的应用  9-10
    1.1.2 米曲霉发酵方式的选择  10-11
  1.2 蛋白酶  11-12
  1.3 中性蛋白酶  12-16
    1.3.1 中性蛋白酶的来源  12-13
    1.3.2 中性蛋白酶的应用  13-14
    1.3.3 中性蛋白酶的发展趋势  14-16
  1.4 立题依据  16-17
  1.5 本课题的研究内容  17-19
2 材料与方法  19-31
  2.1 材料  19-21
    2.1.1 菌种  19
    2.1.2 培养基  19
    2.1.3 主要试剂  19-21
    2.1.4 主要仪器  21
  2.2 试验方法  21-31
    2.2.1 培养方法  21-22
    2.2.2 分析方法  22-25
    2.2.3 米曲霉生产菌株的诱变育种  25-27
    2.2.4 遗传稳定性测定  27
    2.2.5 米曲霉高产中性蛋白酶培养基的优化  27-28
    2.2.6 正交试验优化产游离氨基酸培养基的组成  28-31
3 结果与讨论  31-55
  3.1 米曲霉高产中性蛋白酶菌株的诱变育种  31-38
    3.1.1 紫外线诱变  31-34
    3.1.2 硫酸二乙酯（DES）诱变  34-37
    3.1.3 传代培养  37-38
    3.1.4 小结  38
  3.2 米曲霉高产中性蛋白酶菌株培养条件的优化  38-52
    3.2.1 培养时间对对产中性蛋白酶的影响  38-39
    3.2.2 不同氮源对产中性蛋白酶的影响  39-40
    3.2.3 不同碳源对产中性蛋白酶的影响  40
    3.2.4 碳氮比(C/N)对产中性蛋白酶的影响  40-41
    3.2.5 温度对对产中性蛋白酶的影响  41-42
    3.2.6 不同比例的干物质与水(即料水比)对产中性蛋白酶的影响  42-43
    3.2.7 pH 值对产酶的影响  43-44
    3.2.8 表面活性剂对产酶的影响  44-47
    3.2.9 无机盐对产中性蛋白酶的影响  47-48
    3.2.10 响应面法优化米曲霉培养基  48-52
  3.3 中性蛋白酶在大豆发酵中的应用  52-54
  3.4 小结  54-55
4 结论  55-57
5 展望  57-59
参考文献  59-61
致谢  61-62

米曲霉产中性蛋白酶高产菌株的选育及其发酵条件优化

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