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出芽短梗霉Aureobasidium pullulans ATCC201428发酵产聚苹果酸的研究

作　者: 邱伟
导　师: 王菊芳
学　校: 华南理工大学
专　业: 发酵工程
关键词: 出芽短梗霉 聚苹果酸 响应面法 离心填充床反应器 固定化
分类号: TQ921
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


聚苹果酸（polymalic acid，PMLA）是一种以L-苹果酸为唯一单体、完全生物可降解性的高分子聚合物，具有极佳的水溶性、易修饰性、易代谢性和生物相溶性，在作为药物载体、生物医学材料、化妆品的添加剂及食品包装材料等方面具有广阔的应用前景。目前，微生物发酵法存在发酵周期长、产率低的问题，为克服这些问题，本文首次采用离心填充床反应器（CPBR）固定化发酵合成PMLA来提高产率。本试验首先在摇瓶条件下对出芽短梗霉发酵特性进行系统研究，主要探讨葡萄糖浓度、碳源、氮源、pH、金属离子、碳酸钙添加量等因素对PMLA产量的影响，用响应面法进行培养基成分优化，以期最大限度的提高PMLA的发酵产量，产率，得率。研究结果表明，出芽短梗霉能够利用多种碳源合成PMLA，以蔗糖为最佳；该菌株能利用有机氮源和无机氮源，而无机氮源更能促进PMLA的合成；添加中间代谢物琥珀酸，1%碳酸钙、微量的Mg2+和保持中性的发酵环境，对PMLA的合成有促进作用。经响应面法优化发酵培养基组成，得出最利于PMLA合成的培养组成为：蔗糖93.2g/L，硝酸钠2.4g/L，丁二酸3.4g/L，MgSO4·7H2O0.1mmol/L，KH2PO40.1g/L，KCl0.5g/L，CaCO310g/L。拟合方程计算得理论PMLA产量为9.08g/L，经实验验证，PMLA的平均产量可达8.94g/L，较原来未经优化前提高了123.5%。本研究初步探讨了出芽短梗霉菌利用离心填充床反应器（centrifugal packed-bedreactor，CPBR）模式生产PMLA的可行性以及不同发酵模式的特点和相对传统发酵模式的优势。在CPBR可行性的研究中，通过对出芽短梗霉菌吸附能力的研究，发现对数生长中期的菌体在纤维质材料上的吸附能力更强，棉纤维织物上的细胞负载量更大，比对数生长前期和后期分别提高了46.0%、27.8%；在偏中性的环境中，细胞吸附能力最高；添加80g/L蔗糖或2.4g/L的NaNO3，都能显著地提高细胞的负载量。在CPBR固定化连续发酵的研究中，对稀释率和流加蔗糖浓度进行了优化，结果表明，稀释率和蔗糖浓度的最佳配比为0.10h-1和20g/L；CPBR固定化连续发酵与CPBR批次发酵、游离批次发酵和游离连续发酵相比，PMLA的产率分别提高了183%、400%和40%，而PMLA得率分别提高了132%、144%和70%，糖利用率更高，说明CPBR固定化连续发酵工艺能够有效地提高PMLA的产率。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-8
目录  8-13
第一章 绪论  13-27
  1.1 聚苹果酸概述  13-16
    1.1.1 聚苹果酸的结构  13-14
    1.1.2 聚苹果酸的性质  14-15
    1.1.3 聚苹果酸的用途  15-16
      1.1.3.1 作为药物载体及微胶囊材料  15
      1.1.3.2 聚苹果酸作为生物医学材料  15
      1.1.3.3 聚苹果酸作为吸水材料  15-16
  1.2 聚苹果酸的合成方法  16-23
    1.2.1 化学法合成聚苹果酸  16-17
    1.2.2 微生物法合成聚苹果酸  17-22
      1.2.2.1 以出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)发酵生产β-聚苹果酸  18
      1.2.2.2 以氧化黑酵母（Aureobasidium sp.)发酵生产β-聚苹果酸  18
      1.2.2.3 以多头绒泡菌(Physarum polycephalum)发酵生产β-聚苹果酸  18-19
      1.2.2.4 利用非生长型细胞发酵合成β-聚苹果酸  19-20
      1.2.2.5 β-聚苹果酸在微生物细胞内的生物合成途径  20-22
    1.2.3 聚苹果酸各种合成方法的比较  22-23
  1.3 出芽短梗霉概述  23
    1.3.1 出芽短梗霉的分类  23
    1.3.2 出芽短梗霉的两态性  23
  1.4 细胞固定化和离心填充床生物反应器  23-26
    1.4.1 细胞固定化  23-24
    1.4.2 细胞固定化制备方法  24-25
    1.4.3 离心填充床反应器  25-26
  1.5 本论文的研究内容与意义  26-27
    1.5.1 研究意义  26
    1.5.2 研究内容  26-27
第二章 出芽短梗霉 Aureobacidium pullulansATCC201428 的基本发酵条件研究  27-43
  2.1 引言  27
  2.2 材料与方法  27-36
    2.2.1 菌株  27
    2.2.2 仪器与试剂  27-29
      2.2.2.1 主要仪器  27-28
      2.2.2.2 主要试剂  28-29
      2.2.2.3 常用溶液配制  29
    2.2.3 培养基  29-30
    2.2.4 培养方法  30
    2.2.5 分析测定方法  30-34
      2.2.5.1 细胞浓度测定  30
      2.2.5.2 pH 的测定  30
      2.2.5.3 发酵液中碳源浓度的测定  30-32
      2.2.5.4 发酵液中 PMLA 浓度检测  32-34
    2.2.6 发酵参数定义  34
    2.2.7 实验方法  34-36
      2.2.7.1 出芽短梗霉 ATCC201428 的发酵特性曲线  34
      2.2.7.2 不同碳源对 PMLA 产量的影响  34
      2.2.7.3 蔗糖浓度对 PMLA 产量的影响  34
      2.2.7.4 不同氮源对 PMLA 产量的影响  34-35
      2.2.7.5 中间代谢物对 PMLA 产量的影响  35
      2.2.7.6 碳酸钙添加量对 PMLA 产量的影响  35
      2.2.7.7 初始 pH 值对 PMLA 产量的影响  35
      2.2.7.8 金属离子对 PMLA 产量的影响  35-36
  2.3 结果与讨论  36-42
    2.3.1 出芽短梗霉 ATCC201428 的生长发酵特性  36
    2.3.2 不同碳源对 PMLA 产量的影响  36-37
    2.3.3 蔗糖浓度对 PMLA 产量的影响  37-38
    2.3.4 不同氮源对 PMLA 产量的影响  38-39
    2.3.5 中间代谢物对 PMLA 产量的影响  39-40
    2.3.6 碳酸钙添加量对 PMLA 产量的影响  40
    2.3.7 初始 pH 值对 PMLA 产量的影响  40-41
    2.3.8 金属离子对 PMLA 产量的影响  41-42
  2.4 本章小结  42-43
第三章 响应面法优化聚苹果酸发酵培养基  43-54
  3.1 引言  43
  3.2 材料与方法  43-48
    3.2.1 菌株  43
    3.2.2 仪器与试剂  43-45
      3.2.2.1 主要仪器  43-44
      3.2.2.2 主要试剂  44-45
      3.2.2.3 常用溶液配制  45
    3.2.3 培养基  45-46
    3.2.4 培养方法  46
    3.2.5 实验方法  46-48
      3.2.5.1 P-B 实验  46
      3.2.5.2 最陡爬坡实验  46-47
      3.2.5.3 中心复合实验（CCD）  47-48
  3.3 结果与讨论  48-52
    3.3.1 P-B 实验优化 PMLA 的培养基  48-50
    3.3.2 最陡爬坡实验  50
    3.3.3 中心复合实验（CCD）  50-52
  3.4 本章小结  52-54
第四章 离心填充床固定化出芽短梗霉发酵产 PMLA 的研究  54-70
  4.1 引言  54
  4.2 实验材料与方法  54-60
    4.2.1 菌种  54
    4.2.2 仪器与试剂  54-56
      4.2.2.1 主要仪器  54-55
      4.2.2.2 主要试剂  55-56
    4.2.3 培养基  56-57
    4.2.4 离心填充床固定化反应器的构建  57-58
    4.2.5 实验方法  58-60
      4.2.5.1 出芽短梗霉游离罐批次发酵  58
      4.2.5.2 游离连续发酵  58
      4.2.5.3 出芽短梗霉吸附试验  58-59
      4.2.5.4 稀释率对 CPBR 连续发酵产 PMLA 的影响  59
      4.2.5.5 流加培养基中蔗糖浓度对 CPBR 连续发酵产 PMLA 的影响  59
      4.2.5.6 CPBR 固定化批次发酵  59-60
      4.2.5.7 CPBR 固定化连续发酵  60
  4.3 结果与讨论  60-68
    4.3.1 出芽短梗霉游离细胞批次发酵  60-61
    4.3.2 出芽短梗霉游离罐连续发酵  61-62
    4.3.3 出芽短梗霉 CPBR 固定化的研究  62-67
      4.3.3.1 出芽短梗霉对 CPBR 的吸附能力研究  62-64
      4.3.3.2 出芽短梗霉固定化连续发酵工艺条件探索  64-65
      4.3.3.3 CPBR 批次发酵与连续发酵对比  65-67
    4.3.7 CPBR 固定化发酵与游离发酵的对比  67-68
  4.4 本章小结  68-70
第五章 结论与展望  70-73
  5.1 结论  70-71
  5.2 展望  71-73
参考文献  73-79
攻读博士/硕士学位期间取得的研究成果  79-80
致谢  80-81
附件  81

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制有机酸
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