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紫草LeTCP4基因的克隆及功能分析

作　者: 朱煜
导　师: 杨永华
学　校: 南京大学
专　业: 制药工程
关键词: 紫草宁 LeTCP4 TCP基因 miR319 茉莉酸
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


紫草具有抗肿瘤、抗菌、消炎等重要的药用价值,紫草的这些药用价值源于紫草的一类重要次生代谢产物——紫草宁及其衍生物。关于紫草宁及其衍生物的合成代谢及调控机理已成为该研究领域的热点问题。目前,人们已经应用植物组织培养技术来商业化生产紫草宁及其衍生物,并建立了紫草细胞的两阶段培养体系。在本课题组前期研究工作中发现,紫草细胞从B5固体培养基转到M9液体培养基后,内源茉莉酸合成大幅增加。在植物应激反应和次生代谢调控中,茉莉酸酮酯起着至关重要的作用,而且在植物发育的各个阶段也具有重大的意义。植物miRNA主要调控DNA结合转录因子。有研究表明,拟南芥中受miR319调控的第二类TCP (TEOSINTE RANCHED/CYCLOIDEA/PCF)转录因子调控下游基因的表达,miR319调控的TCPs对于叶片的生长起重要作用。通过全基因组的组合以及生化和遗传研究,确定TCP可调控激素茉莉酸的合成。研究分析还表明,增加植物叶片提取物miR319的活性,可改变了合成茉莉酸基因的表达。从而导致茉莉酸水平改变。而植物变得衰老的现象在茉莉酸的诱导下而又恢复正常。在aw突变体中,miR319过表达导致多个TCP基因受到抑制。为了详细研究TCP转录因子在紫草宁合成过程中的调控作用,我们通过TCP基因家族的保守序列设计引物,扩增出LeTCP4的部分片段,并使用RACE方法从紫草中得到了全长LeTCP4基因。生物信息学分析表明,LeTCP4基因属于第二类TCP基因家族中的CIN亚家族。将LeTCP4基因在jaw突变体中进行了异源过表达的功能互补实验,结果表明LeTCP4基因可以基本从突变体叶片卷缩的表型回复到野生型的平展表型,植株的角果也基本回复到野生型表面比较平滑的表型。LeTCP2基因在拟南(?)jaw突变体中的过表达提高了植株中茉莉酸合成及信号转导相关的基因表达,另外也调控了生长素、脱落酸和赤霉素等激素的合成。实验结果验证了LeTCP2基因可以促进茉莉酸的合成,推测其可能在紫草宁的合成调控过程中起到关键的作用。

全文目录


中文摘要  7-9
Abstract  9-11
第一部分：文献综述  11-24
  1. 紫草及其次生代谢产物  11
  2. 紫草次生代谢产物紫草宁的合成途径  11-14
  3. 紫草宁合成调控机制研究进展  14
  4. 植物内源激素茉莉酸的生物合成途径及其调控机制  14-19
    4.1 茉莉酸类物质的生物合成途径  14-16
    4.2 茉莉酸的信号传递及其分子调控机制  16-19
  5. TCP基因家族的研究进展  19-24
    5.1 TCP转录因子的结构  19-20
    5.2 TCP转录因子家族的分类和调控机制  20-21
    5.3 miR319靶向作用于TCPs转录因子调控植物器官的机制  21-22
    5.4 TCP基因在植物中的作用  22-24
第二部分：研究论文  24-47
  第一章 紫草LeTCP4基因及启动子的克隆与序列分析  24-35
    1. 引言  24
    2. 材料与方法  24-27
      2.1 实验材料  24-25
      2.2 LeTCP4基因的克隆及生物信息学分析  25-26
      2.3 染色体步移法克隆LeTCP4基因启动子  26-27
    3. 结果与分析  27-35
      3.1 LeTCP4基因的克隆及生物信息学分析  27-30
      3.2 LeTCP4基因启动子的克隆及序列分析  30-35
  第二章 LeTCP4转基因拟南芥功能互补分析及内源激素含量分析  35-47
    1. 引言  35
    2. 材料与方法  35-40
      2.1 实验材料  35
      2.2 LeTCP4-pMDC83过表达载体的构建  35-38
      2.3 冻融法转化农杆菌GV3101  38
      2.4 农杆菌花序侵染法转化拟南芥  38-39
      2.5 转基因LeTCP4拟南芥的筛选  39
      2.6 LeTCP2转基因拟南芥纯合体的筛选  39
      2.7 LeTCP2转基因拟南芥内源激素含量的提取与检测  39-40
    3. 结果与分析  40-47
      3.1 LeTCP4-pMDC83过表达载体的构建及阳性克隆PCR鉴定  40-41
      3.2 LeTCP4转化农杆菌GV3101阳性克隆PCR鉴定  41-42
      3.3 农杆菌侵染转化拟南芥  42
      3.4 jaw-LeTCP4转基因拟南芥表达的表型  42-44
      3.5 LeTCP2转基因拟南芥纯合体的筛选  44-45
      3.6 LeTCP2转基因拟南芥内源激素含量分析  45-47
全文讨论  47-49
全文结论  49-50
参考文献  50-57
致谢  57-58

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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