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人、中国麂减数分裂遗传重组分析

作　者: 杨庆岭
导　师: 史庆华
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 遗传学
关键词: 精子发生减数分裂联会复合体(SC) 遗传重组中国麂(Muntiacus reevesi) miRNA 人类睾丸男性不育
分类号: Q75
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

哺乳动物中,精子发生是一个复杂而且受到严格调控的过程,减数分裂前期Ⅰ,同源染色体的配对联会以及重组的发生十分重要,它可以确保同源染色体相互分离并最终形成正常的配子,重组发生的位置和数目异常时往往会导致异常配子的产生。同时,越来越多的研究表明小RNAs在精子发生过程中发挥重要作用,为探讨哺乳动物中遗传重组发生的机制以及精子发生过程中小RNAs可能的调控机制分别做了以下三部分工作：1.麂科动物(Muntiacus, Cervidaei)-直被广泛用来研究染色体及核型演化,然而,对于它们减数分裂过程中同源染色体的行为,尤其是减数分裂重组的频率和分布模式知之甚少。本部分研究中,以中国麂(Muntiacus reevesi)为研究对象,利用微铺展法将其精母细胞联会复合体铺展开,结合免疫荧光技术,用联会复合体侧轴蛋白SCP3,错配修复蛋白MLH1以及着丝粒蛋白CREST的抗体来显示联会复合体以及重组位点和着丝粒的位置。对于170个粗线期细胞进行重组和分布模式分析,结果显示39.4%的XY二价体上没有重组位点,然而常染色体中只有0.5%没有重组位点,平均每个粗线期细胞重组位点数为29.8,范围为24-34；重组位点MLH1在联会复合体上的分布和其他哺乳动物相比存在差异：当一条联会复合体上有一个重组位点时,在联会复合体上分布相对分散；当联会复合体上有两个重组位点时,在亚端粒部位有一个较大的峰,而且总体上雄性中国麂重组位点间的干扰强度要低,这些都和雄性小鼠和人类男性中MLH1分布模式存在明显不同,提示在雄性中国麂中,同源染色体重组的模式和其他的哺乳动物有些许不同,这也为我们更深刻的理解哺乳动物减数分裂同源染色体重组(重组频率和重组数目)发生的机制提供很好的提供有利线索。2.长期以来,减数分裂重组频率与联会复合体长度之间的关系一直是人们研究的兴趣所在,但二者之间相互关系却未被详尽的阐述过。为了更深入的探讨这一问题,我们测量了10个正常男性889个粗线期精母细胞中的19558条联会复合体长度,同时以MLH1作为重组的标记物,统计了联会复合体上的重组频率。我们看到二者之间有一个非常复杂的关系。在这10个人中有8个二者之间呈现正相关关系,其中有3个为较弱的正相关,其他5个为中等程度的正相关,在另外2个研究对象中,我们首次发现单个细胞中联会复合体长度与重组频率无相关性。而且,在不同人之间,甚至在同一个人的不同细胞之间,大多数联会复合体长度相似的细胞,其重组位点数目也不相同,反之亦然。本研究为阐述联会复合体长度和重组频率之间的关系提供了直接的证据,为以后研究二者之间机制关系提供有力的数据支持。3. miRNAs是一类内源性RNA分子,可以在转录和转录后水平调控基因的表达。一直以来人们都致力于在各个物种中发现新的miRNAs并试图了解他们的功能。然而利用第二代深测序技术对于人类睾丸组织中miRNAs的表达谱至今没有相关报道。本部分研究旨在利用Solexa测序技术构建正常人类男性中miRNAs和piRNAs的表达谱。我们共检测到770条已知的miRNAs和5个条新的miRNAs以及20121条piRNAs,同时也表明人类睾丸组织中有大量的小RNAs存在。我们选择了15条已知的和5条新的miRNAs利用qRT-PCR来验证测序的可靠性。我们分析了表达较丰富的以及新的miRNAs的靶基因,并用GO分析预测这些基因可能参与的生物学过程。结果提示这些miRNA参与了很多重要的生物学过程,其中包括精子发生过程中的减数分裂以及p53中相关的调节通路。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
目录  9-12
第一章绪论  12-38
  1.1 引言  12-13
  1.2 减数分裂概述  13-18
    1.2.1 减数分裂的概念  13
    1.2.2 减数分裂前期I染色体行为  13-15
    1.2.3 减数分裂染色体的分离  15-18
      1.2.3.1 减数分裂过程中cohesin蛋白复合体的作用  16
      1.2.3.2 cohesin蛋白复合体的组成、定位及降解  16-17
      1.2.3.3 separase的活化机制  17
      1.2.3.4 减数分裂过程中着丝粒部位cohesin的分步降解机制  17-18
  1.3 减数分裂同源染色体的交换重组及其机制  18-26
    1.3.1 联会复合体  18-19
    1.3.2 同源染色体的配对和联会  19-20
    1.3.3 同源染色体重组产物  20-22
    1.3.4 DSBs的产生及其调控机制  22-24
    1.3.5 重组的干扰效应  24-26
  1.4 重组与非整倍体配子产生  26-27
  1.5 损害男性生育能力的细胞遗传学因素  27-32
    1.5.1 染色体核型异常  28-30
      1.5.1.1 性染色体异常  28-29
      1.5.1.2 染色体结构异常  29-30
    1.5.2 染色体间效应  30
    1.5.3 Y染色体微缺失  30-31
    1.5.4 核型正常的不育男性  31
    1.5.5 同源染色体联会重组分析  31-32
    1.5.6 减数分裂基因突变  32
  1.6 MicroRNA概述  32-38
    1.6.1 精子发生的小RNAs调控  33-34
    1.6.2 miRNA参与转录后调控的机制  34-35
    1.6.3 miRNA与男性生殖  35-38
第二章雄性中国麂减数分裂联会重组分析  38-52
  2.1 引言  38-40
  2.2 材料和方法  40-42
    2.2.1 雄性中国麂睾丸组织  40
    2.2.2 实验试剂  40-41
    2.2.3 中国麂精母细胞荧光免疫染色  41
    2.2.4 精母细胞图像采集及分析标准  41-42
    2.2.5 重组图谱构建以及数据分析  42
    2.2.6 统计学方法  42
  2.3 实验结果和讨论  42-50
  2.4 本章小结  50-52
第三章正常男性精母细胞减数分裂遗传重组频率与联会复合体长度之间的关系  52-62
  3.1 前言  52
  3.2 材料和方法  52-53
    3.2.1 睾丸组织  52-53
    3.2.2 联会复合体制备及荧光免疫染色  53
    3.2.3 精母细胞图像采集及分析标准  53
    3.2.4 统计方法  53
  3.3 实验结果  53-57
    3.3.1 不同个体/同一个体不同细胞之间常染色体SC长度以及重组频率的差异性  53-55
    3.3.2 每个细胞中MLH1位点数目与常染色体SC总长之间的复杂关系  55-57
  3.4 讨论  57-60
  3.5 本章小结  60-62
第四章利用深测序技术建立正常人类睾丸组织中miRNA和piRNA表达谱  62-76
  4.1 引言  62-63
  4.2 材料和方法  63-66
    4.2.1 睾丸组织收集  63
    4.2.2 小RNAs文库的建立与测序  63
    4.2.3 小RNAs分析  63-64
    4.2.4 Novel miRNAs的预测  64
    4.2.5 miRNAs靶基因的预测  64
    4.2.6 miRNA靶基因的GO分析  64-65
    4.2.7 miRNA靶基因参与的信号通路分析  65
    4.2.8 RT-PCR  65-66
  4.3 研究结果  66-72
    4.3.1 小RNAs序列分析  66-67
    4.3.2 高丰度的已知miRNAs在染色体上的定位分析  67-68
    4.3.3 Novel miRNAs的分析  68-69
    4.3.4 睾丸组织中表达大量的piRNAs  69
    4.3.5 miRNAs靶基因预测  69-72
  4.4 讨论  72-75
  4.5 本章小结  75-76
参考文献  76-102
附录  102-106
中英文对照表  106-108
在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果  108-110
致谢  110

人、中国麂减数分裂遗传重组分析

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