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拟南芥RopGEF4和RopGEF10介导的根毛的生长

作　者: 黄国强
导　师: 张彦
学　校: 山东农业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 根毛 FER GEF4/10 磷 ROS
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

根毛作为植物伸出体外的管状细胞，在吸收水分和营养物质，固定植物及感受外界信号的过程中起着重要作用。根毛提供了一个优秀的体系去研究基本的生物问题，例如，细胞命运的决定、根毛的起始和极性生长。在已有的研究中，报道了大量与根毛生长和发育有关的突变体，根毛数目增多的突变体：gl2，ttg，wer，pom1；根毛数目减少的突变体：cpc，rhl1，rhl2，rhl3；根毛分叉的突变体：cow1，cen1，cen2，cen3，lrx1，rhd1，rhd3；根毛呈波浪形弯曲生长的突变体：rhd4，arp2，agd1。根毛的生长和发育受到多方面因素的影响，活性小G蛋白对根毛的极性生长起到分子开关的作用，对根毛的发育起到一个关键性的作用。通过由非活性状态到活性状态的转变，活性小G蛋白调控广泛的细胞活动，例如微丝的聚合，ROS的产生和钙的浓度梯度的维持。本论文以拟南芥为研究材料，在以下五方面研究了根毛中存在的信号途径FER-GEFs-ROP-ROS：（1）尽管GEF4和GEF10作为同一家族在根毛中高量表达的的基因，但GEF4和GEF10在根毛的发育过程中发挥不同的作用。（2）为了放大GEF4和GEF10之间功能的不同。我们使用了根毛特异性的强启动子EXPA7，驱动的GEF4和GEF10在根毛内的过表达。通过对GEF4和GEF10过表达的表型进行分析，我们发现，GEF4过表达的植物根毛呈现显著弯曲的表型，GEF10过表达的植物根毛呈现显著分叉的表型。（3）通过对GEF4和GEF10的二级结构分析和区域互换实验，我们证明N端对GEF4的功能是必不可少的，C端对GEF10的功能是必不可少的。（4）FER在gef4gef10中过表达植物根毛中ROS的含量，显著地低于FER在野生型中过表达根毛中的ROS含量。从遗传上，我们证明FER位于GEF4和GEF10的上游，通过GEF4和GEF10进而参与ROS的调控。（5）对gef4gef10和fer-4进行生长素和低磷诱导的胁迫处理，我们发现，fer-4不响应生长素的诱导和低磷胁迫的处理，gef4gef10对生长素的诱导和低磷的胁迫处理，呈现敏感性的响应。由此我们得出结论，FER感受生长素和低磷胁迫，调节根毛的生长和发育，但并不依赖于GEF4和GEF10。

全文目录

符号说明  4-8
中文摘要  8-10
Abstract  10-12
1 前言  12-24
  1.1 根毛研究现状  12
  1.2 拟南芥根毛的发生基础  12-17
    1.2.1 根毛细胞的分化基础  12-15
    1.2.2 根毛细胞的极性生长  15-17
      1.2.2.1 根毛的起始  15-16
      1.2.2.2 根毛的极性生长  16-17
  1.3 小 G 蛋白在根毛生长中所起的作用  17-19
    1.3.1 小 G 蛋白的种类和功能  17-18
    1.3.2 小 G 蛋白的调节机制  18-19
    1.3.3 小 G 蛋白对根毛生长的影响  19
  1.4 ROS 对根毛的生长是必须的  19-21
    1.4.1 NADPH 氧化酶对根毛的生长和发育是必需的  20
    1.4.2 ROS 在 scn1 中的分布呈现扩大化的趋势  20-21
  1.5 发育信号和环境信号对根毛生长的影响  21-23
    1.5.1 生长素对根毛的影响  21-22
    1.5.2 营养元素对根毛生长的影响  22-23
  1.6 RLK 对根毛生长的影响  23-24
2 材料与方法  24-36
  2.1 实验材料  24
    2.1.1 植物材料  24
    2.1.2 菌株与质粒  24
    2.1.3 酶与各种生化试剂  24
  2.2 实验方法  24-36
    2.2.1 植物基因组的提取与纯化  24-25
      2.2.1.1 植物基因组的提取  24-25
    2.2.2 载体构建  25-27
      2.2.2.1 PCR 扩增  25
      2.2.2.2 连接反应  25-26
      2.2.2.3 菌落 PCR 及测序  26
      2.2.2.4 LR 反应  26-27
      2.2.2.5 酶切鉴定表达载体  27
    2.2.3 PCR 鉴定纯合突变体植株  27
    2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化  27-28
      2.2.4.1 大肠杆菌感受态细胞的制备  27-28
      2.2.4.2 大肠杆菌细胞的转化  28
    2.2.5 大肠杆菌中质粒的提取  28-29
    2.2.6 农杆菌感受态细胞的制备和转化  29
      2.2.6.1 根癌农杆菌 GV3101 感受态细胞的制备  29
      2.2.6.2 冻融法转化农杆菌细胞  29
    2.2.7 拟南芥的转化及转基因拟南芥的鉴定  29-30
      2.2.7.1 拟南芥的转化  29-30
      2.2.7.2 转基因拟南芥的鉴定  30
    2.2.8 RNA 的提取纯化与反转录  30-31
      2.2.8.1 RNA 提取  30
      2.2.8.2 RNA 的反转录  30-31
    2.2.9 半定量 PCR 和实时定量 PCR  31-32
      2.2.9.1 半定量 PCR  31
      2.2.9.2 实时定量 PCR  31-32
    2.2.10 ROS 荧光强度的测定  32-33
      2.2.10.1 植物材料准备  32
      2.2.10.2 染色方法及照相  32-33
      2.2.10.3 荧光量化处理  33
    2.2.11 FM4-64 染色分析  33
    2.2.12 植物体内活性小 G 蛋白的提取和检测  33-35
      2.2.12.1 活性小 G 蛋白的提取  33
      2.2.12.2 Pull-down 和 western blot 实验  33-35
    2.2.13 对植物进行磷处理  35-36
3 结果与分析  36-43
  3.1 GEF4 和 GEF10 突变体鉴定及表型分析  36-37
  3.2 在 gef4gef10 突变体中，ROS 和活性小 G 蛋白的量明显减少  37-38
  3.3 GEF4 和 GEF10 过表达的表型分析  38
  3.4 GEF4 和 GEF10 结构域的功能分析  38-40
  3.5 FER 对生长素和磷的响应不依赖于 GEF4 和 GEF1033  40-41
  3.6 FER 在 gef4gef10 中过表达，ROS 的产量降低  41-42
  3.7 本实验的模型  42-43
4 讨论  43-44
5 结论  44-45
参考文献  45-51
致谢  51-52
攻读学位期间发表论文情况  52

拟南芥RopGEF4和RopGEF10介导的根毛的生长

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