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一个用于研究根尖生长素回流过程的拟南芥EMS突变体库的构建与筛选分析

作　者: 黄雅琼
导　师: 须健
学　校: 华中农业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 拟南芥(Arabidopis thaliana) 根 EMS诱变生长素回流突变体库
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

拟南芥是重要的双子叶模式植物。植物根系是重要的吸收水分和营养的器官,并且起到固着土壤的作用。生长素是一类重要的植物内源激素,它对植物根系发育的很多方面产生重要影响,包括侧根的起始和萌发,根尖分生组织的形成,向重力性以及主根伸长。生长素从合成的部位定向向作用部位转移从而调控植物生长,这种运输方式称为生长素极性运输。拟南芥器官形成时,生长素在原基顶端存在极大值。该现象主要是由生长素输出载体PIN蛋白的不对称分布决定的,这些PIN蛋白在植物地上和地下部分相互协调调控生长素分布。在拟南芥根系发育过程中,破坏生长素输出会强烈地影响根尖生长素回流现象,从而影响根尖生长素浓度极值的形成、细胞分裂起始以及植物器官形成。调控生长素在根尖回流的机制至今仍不清楚。为了揭示参与调控生长素回流的分子机理,本研究采用正向遗传学方法,通过筛选WOX5::IAAH-DR5::GFP EMS突变体库进行研究。该系统的工作原理是,在外源施加IAA合成前体IAM时,可以实现在静止中心合成生长素的目的,并且通过DR5-GFP报告基因指示生长素累积和分布的变化。本研究主要结果如下：1、建立了与本研究体系相适应的筛选方法。通过外源施加IAM筛选M2代植株。以根尖根毛密度、荧光强度为处理早期指标,以主根长度、侧根数目及长度、下胚轴长度、向重力性等为处理后期指标,筛选获得根部具有稳定表型的突变体。2、通过初筛、再次初筛、复筛,获得候选家系55个。并通过分析候选家系自交表型分离比,判断是否已经纯合。将已纯合的候选家系中表型相近的突变体分成一组,所有候选家系共分为8组。3、采用外源施加生长素及生长素极性运输抑制剂NPA,观察突变体表型,并与施加IAM后突变体表型进行对比,进一步分析导致突变体表型产生的原因。4、采用重力转角刺激方法,观察突变体对重力刺激的反应。结果表明,候选家系中除了向地性消失家系,其余家系的重力刺激反应都与对照无明显区别。5、将候选家系进行组内杂交,根据F1代植株表型是否与亲本相似,判断是否为等位突变体。最终获得5对等位突变体。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略词表  10-11
1 前言  11-24
  1.1 生长素运输方式的研究进展  11-13
    1.1.1 生长素进入细胞方式的研究  11
    1.1.2 生长素极性运输与PIN蛋白定位  11-12
    1.1.3 生长素输入载体研究进展  12
    1.1.4 生长素输出载体研究进展  12-13
  1.2 生长素合成的研究进展  13-14
  1.3 生长素与植物根系发育的研究进展  14-20
    1.3.1 拟南芥根系形态及结构  14-16
    1.3.2 生长素与拟南芥根表皮发育研究进展  16
    1.3.3 生长素与拟南芥维管组织发育研究进展  16-17
    1.3.4 生长素与拟南芥侧根发育研究进展  17-18
    1.3.5 生长素与拟南芥不定根发育研究进展  18-19
    1.3.6 生长素与拟南芥根系向重力性研究进展  19-20
  1.4 生长素回流与根发育的研究进展  20-21
    1.4.1 拟南芥根尖生长素浓度梯度的形成  20
    1.4.2 生长素回流现象  20
    1.4.3 参与生长素回流的基因  20-21
    1.4.4 生长素回流对根发育的作用  21
  1.5 本研究采用系统的工作原理  21-23
  1.6 本研究目的和意义  23-24
2 材料与方法  24-27
  2.1 材料  24
  2.2 实验方法  24-27
    2.2.1 EMS诱变方法  24
    2.2.2 1/2 MS培养基配制  24
    2.2.3 拟南芥种子灭菌及幼苗生长培养条件  24-25
    2.2.4 IAM处理方法及筛选观察指标  25
    2.2.5 外源生长素及NPA处理方法及观察指标  25
    2.2.6 重力转角刺激处理方法及观察指标  25-26
    2.2.7 杂交方法  26
    2.2.8 等位突变体判断方法  26-27
3 结果与分析  27-48
  3.1 EMS突变体库筛选方法的建立  27-28
  3.2 突变体库初筛、复筛确定候选家系以及候选家系表型分组  28-39
    3.2.1 突变体库初筛  28-29
    3.2.2 突变体库复筛确定候选家系  29-30
    3.2.3 候选家系表型分组举例  30-39
      3.2.3.1 40 nmol/L IAM处理早期有表型,后期无表型突变体  30-31
      3.2.3.2 40 nmol/L IAM处理后主根长受到抑制突变体  31-32
      3.2.3.3 短根突变体  32-33
      3.2.3.4 侧根突变体  33-35
        3.2.3.4.1 侧根减少突变体  33-34
        3.2.3.4.2 侧根数目增加突变体  34-35
      3.2.3.5 向地性消失突变体  35-36
      3.2.3.6 下胚轴伸长突变体  36-37
      3.2.3.7 主根长不被高浓度IAM抑制突变体  37-38
      3.2.3.8 根部呈波浪形生长突变体  38-39
  3.3 等位突变体获得及表型  39-45
    3.3.1 等位突变体获得  39-40
    3.3.2 等位突变体表型  40-45
      3.3.2.1 下胚轴伸长等位突变体(496、515)  40-41
      3.3.2.2 根部呈波浪形生长突变体(243、279)  41-42
      3.3.2.3 40 nmol/L IAM处理后根长抑制突变体(719、1298)  42-43
      3.3.2.4 40 nmol/L IAM处理后根长抑制突变体(738、733)  43-44
      3.3.2.5 主根长不被高浓度IAM抑制突变体(1287、92)  44-45
  3.4 外源生长素及NPA处理候选家系  45-47
    3.4.1 外源生长素及NPA处理条件确定  45-46
    3.4.2 生长素输入载体auxl的等位突变体获得  46-47
  3.5 重力转角刺激处理候选家系  47-48
4 讨论  48-51
  4.1 研究体系优势  48
  4.2 筛选方法特点  48-49
  4.3 候选家系获得意义  49
  4.4 部分候选家系的后续研究计划  49-50
  4.5 结束语  50-51
参考文献  51-60
致谢  60

一个用于研究根尖生长素回流过程的拟南芥EMS突变体库的构建与筛选分析

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