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造血干细胞移植术后sFractalkine与aGVHD关系的初步研究

作　者: 王希晶
导　师: 吴秉毅
学　校: 南方医科大学
专　业: 血液内科学
关键词: 造血干细胞移植趋化因子可溶性不规则趋化因子急性移植物抗宿主病
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是治疗恶性血液病的有效方法。但急性移植物抗宿主病(aGVHD)是其严重的并发症之一。目前,aGVHD的诊断主要依靠临床症状：如皮肤出现皮疹、肝功损害、腹泻等,缺少相对稳定和可靠的血清学指标。能否寻找一个血清学指标应用于临床的早期诊断及早期预测疾病的状态是临床工作者追求的目标。趋化因子(chemokines, CK)是一类能够调控细胞定向迁移的细胞因子,广泛存在于白细胞如单核细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞,并且通过与相应的趋化因子受体结合从而介导对白细胞的趋化作用。一种趋化因子能与多个趋化因子受体相结合,而一个趋化因子可能有多个高亲和性受体,它们共同构成复杂的网络系统,在许多疾病的发生发展中起到重要作用,如系统性红斑狼疮。迄今为止至少已发现50余种趋化因子,趋化因子结构和功能相似,据其前两个半胱氨酸的相对位置不同,大致可分为4个亚族：C、CC、CXC和CX3C趋化因子。目前已明确的趋化因子受体有20多种,它们属于G蛋白偶联受体超家族,主要表达于骨髓来源的各白细胞亚群,同时也表达于上皮细胞、血管内皮细胞、神经细胞等类型的细胞上。趋化因子首先作为趋化性介质被发现,但随着对趋化因子研究的深入,现在已经认识到趋化因子不但对白细胞具有趋化作用,而且在免疫细胞和器官的发育、免疫应答过程、炎症反应、病原体感染、创伤修复及肿瘤的形成和转移等方面发挥广泛的生理和病理作用。由于其广泛的细胞来源和生物学效应,趋化因子在多种炎性和自身免疫性疾病的发生和发展中起着重要的作用。Fractalkine (Fkn)又称不规则趋化因子,是由体内多种组织细胞分泌的具有黏附功能的趋化因子,是1997年发现的CX3C趋化因子家族中唯一的成员,定位于人染色体16q13,有膜结合型和可溶型两种形式存在,各自发挥使外周血白细胞游走和粘附的作用,因此兼有趋化因子和细胞间粘附分子两种作用。由内皮细胞、成纤维细胞和小胶质细胞表达,当发生炎症时表达上调。大多数Fkn表达在活化的内皮细胞表面,参与白细胞向炎症组织的游走。由于内皮是白细胞跨膜转移的第一道屏障,因此内皮细胞表面的Fkn是控制炎症部位白细胞渗出的门户。而当Fkn的胞外部分被蛋白酶水解,由细胞表面脱落,变成可溶性不规则趋化因子(sFkn)。sFkn趋化单核细胞、NK细胞、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞到血管壁内皮细胞附近,这些炎性细胞被诱导跨膜转移,同时释放干扰素-Y(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、穿孔素和端粒酶等,破坏血管内皮细胞和其他组织细胞,引起血管炎和器官损害。TNF-α能诱导Fkn的脱落,IFN-γ起协同作用,而白介素(IL)-4或IL-13能完全阻断Fkn细胞外片段的脱落,提示这些细胞因子也参与Fkn脱落的调控过程。CX3CR1是Fkn的特异性受体,主要表达在NK细胞、CD8+T细胞、CD14+单核细胞,sFkn分子表现出强有力的趋化这些细胞向上皮细胞、内皮细胞、树枝状细胞黏附的活性。Fkn与CX3CR1相互作用也能通过G蛋白转换信号,提高整合素结合配体的能力。因此,整合素和其配体如ICAM-1(细胞间粘附分子-1)和VCAM-1(血管细胞粘附分子-1)与Fkn/CX3CR1系统共同存在时,可大大提高细胞粘附作用。到目前为止,还没有实验确切证实Fkn/CX3CR1系统引发怎样的细胞内分子水平反应。有研究表明,CX3CR1为G蛋白耦联受体,Fkn与CX3CR1结合以后,可以通过与G蛋白耦联,启动细胞内信号转导机制,促进核因子κB(nuclear factorκB)和TNF-α的表达,从而产生相应的生物学效应。有学者应用磷酸盐缓冲液(空白对照)和Fkn分别诱导人外周血单核细胞,结果发现,Fkn处理组表达NF-KB的阳性细胞数以及TNF-α表达值均比对照组显著增加。在移植免疫中Thl细胞介导排斥反应,而Th2细胞诱导免疫耐受。而TNF-α是Thl型细胞亚群产生的主要细胞因子之一,Fkn可能通过改变Th1/Th2平衡而导致组织损伤,进而发生aGVHD.aGVHD是由移植物中所含供者T细胞识别宿主抗原而攻击宿主组织器官所产生的病理损伤、并导致宿主多脏器损伤的一个疾病过程,是造血干细胞移植常见的严重并发症。研究表明：IL-1、可溶性IL-2受体(sIL-2R)、TNF-α等在发生aGVHD时体内水平明显升高。有研究报道异基因造血干细胞移植术后动态监测TNF-αIL-4、TGF-α水平变化有助于对aGVHD做出诊断,且对判断aGVHD轻重程度有一定的临床意义。但目前总体上还是缺乏一种能够预警aGVHD发生的可靠稳定的方法。国内外有关Fkn的研究多集中在类风湿病、系统性红斑狼疮方面,关于Fkn和aGVHD的相关研究文献鲜见。Robinson等报道Fkn表达升高可显著提高对移植心脏的排斥,尤其表现在血管内皮系统损伤,而给予受者抗-CX3CR1阻断抗体治疗后,明显延长移植物的存活时间；Satoshi Ueha发现对黏膜血管定居因子和Fkn的干预治疗在减轻肠道的移植物抗宿主反应损伤的同时保护了移植物抗肿瘤效应。这些研究提示Fkn表达升高可能预示着aGVHD的发生。而造血干细胞移植患者经大剂量预处理及干细胞植入并经历了造血重建和免疫重建过程,当发生GVHD时,TNF-α、IFN-γ、IL-4都会发生变化,与细胞趋化作用有关的sFkn在体内有无变化,目前该方面的研究报道不多。本研究分两部分,第一部分是建立测定sFkn的方法,为测定allo-HSCT患者移植前后血清sFkn的浓度建立方法,并测定了35例正常人血清sFkn的浓度；第二部分测定20例接受HSCT的恶性血液病患者移植前和移植后不同时间的血清sFkn的浓度,以正常人血清sFkn浓度为对照,探讨sFkn与aGVHD两者之间的关系。目的建立sFkn的测定方法,测定正常人血清sFkn的浓度；观察造血干细胞移植(HSCT)患者体内sFkn的变化,探讨sFkn与急性移植物抗宿主病(aGVHD)的关系。方法第一部分：建立竞争抑制ELISA法测定sFkn,绘制出sFkn的标准曲线；在此基础上测定正常人血清sFkn的浓度。第二部分：用上述建立的竞争抑制ELISA法定量检测20例接受HSCT的恶性血液病患者移植前和移植后不同时间的血清sFkn的浓度,以35例正常人血清sFkn的浓度为对照,分析白血病患者移植前后不同时间血清sFkn的浓度变化及与aGVHD的关系。sFkn抗体等由上海蓝基生物科技有限公司所提供。全部病人和正常人清晨空腹静脉采血,采集后立即离心(1000r/min,5min)分离,取上清-20℃保存待测。1.sFkn测定的具体操作步骤：1).在操作前准备所有的物品,标准品和样品的移取均使用微量移液管。取出试验用品,于室温(20-25℃)放置15-30分钟。实验过程应在室温(20-25℃)内进行；2).取出酶标板,按照标准品的次序分别加入100μl的标准品溶液于空白微孔。空白微孔中加入100μl的样品,空白对照加入100μl的蒸馏水；3).在各孔中加入50μl的酶标记溶液；(不含空白对照孔)。将酶标板用封口胶密封后,37℃孵育反应1小时；(在孵育箱中保持稳定的温度与湿度)；4).洗板.浓缩洗涤液以1：100的比例与蒸馏水稀释,充分清洗酶标板3-5次,保持各孔有充足的水压；酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干；5).各孔加入显色剂A、B液各50μl；(不含空白对照孔)。20-25℃下避光反应15分钟；6).各孔加/入50 u l终止液,终止反应；7).30分钟内在波长450nm的酶标仪上读取各孔的0D值；8).将0D值与标准品浓度进行曲线拟合,建立方程。由电脑自动计算得出结果。2.统计学方法采SPSS18.0统计软件进行曲线拟合,绘制标准曲线。采用SPSS18.0统计软件处理数据。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用独立样本t检验。P<O.05则差异具有显著性意义。结果1.成功建立了sFractalkine的测定方法,建立了标准曲线,在0.5-5 ng/ml之间有良好的的剂量效应关系。批内、批间变异系数分别为14.4%和9.43%。2.正常人血清sFkn的浓度在为3.9325±0.8027ng/ml。3.全部HSCT患者移植前血清sFkn的浓度为4.2806±1.4044ng/ml。其中4例自体HSCT(auto-HSCT)患者移植后15天血清sFkn的浓度为3.6800±1.5451ng/ml；10例异基因HSCT(allo-HSCT)后未发生急性GVHD患者移植后15d血清sFkn的浓度为3.6240±0.9980ng/ml；6例allo-HSCT后发生急性GVHD患者移植后15d血清sFkn的浓度为5.7752±0.6618ng/ml。全部患者移植前,auto-HSCT患者、allo-HSCT后未发生aGVHD的患者,血清sFkn的浓度和正常人比较变化不明显(P>O.05)；发生aGVHD的allo-HSCT患者移植后15天监测到外周血血清sFkn浓度显著升高,和正常人比较有显著性差异(P<0.001)。结论1.用竞争抑制ELISA法可以建立sFractalkine的测定方法；2.正常人血清sFkn的浓度为3.9325±0.8027ng/ml；3.allo-HSCT后发生急性GVHD患者sFkn有升高趋势。但仍需进一步研究。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-18
前言  18-22
第一部分 sFractalkine测定方法的建立  22-27
  1 材料  22-23
  2 方法  23-24
  3 结果  24-26
  4 讨论  26-27
第二部分造血干细胞移植术后sFractalkine与aGVHD关系的初步研究  27-33
  1 材料  27
  2 方法  27-29
  3 结果  29-32
  4 讨论  32-33
参考文献  33-36
全文总结  36-37
中英文缩写词对照表  37-38
综述  38-48
  参考文献  45-48
学习期间撰写或发表的论文  48-49
致谢  49-51
统计学证明  51

造血干细胞移植术后sFractalkine与aGVHD关系的初步研究

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