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红豆杉内生真菌代谢产紫杉烷类物质的研究

作　者: 李娟花
导　师: 邓百万
学　校: 陕西理工学院
专　业: 植物学
关键词: 红豆杉紫杉烷内生真菌发酵条件代谢调控
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

近年来,利用红豆杉内生真菌发酵生产紫杉醇是研究的热点,国内外学者对其进行了大量的研究工作,分离并鉴定有200多株内生真菌可以产紫杉醇,但是研究结果显示,其紫杉醇的产量很低。寻找高产菌株、优化培养条件及研究代谢调控是提高生物活性物质产量及解决紫杉醇资源短缺的一条有效途径。本文以从秦巴山区红豆杉中分离的82株内生真菌为研究对象,进行定性分析,筛选产紫杉醇、巴卡亭Ⅲ（BaccatinⅢ）和10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-DAB）内生真菌,并在此基础上,研究了液体发酵和生长调节剂对紫杉烷类物质的代谢影响。主要研究方法和结果如下:1.采用HPLC及HPLC-MS检测方法,对分离的82株内生真菌的发酵液提取物进行检测。结果表明,有11株内生真菌代谢产生紫杉醇,占内生真菌总数的13.4%;19株内生真菌代谢产BaccatinⅢ,占内生真菌总数的23.2%;9株内生真菌产10-DAB,占内生真菌总数的10.9%。2.在代谢活性成分分析时发现,内生真菌LB-5次生代谢产物包含紫杉醇、BaccatinⅢ和10-DAB,其产量分别为314.29μg/L,565.72μg/L和573.94μg/L。结合形态学特性和ITS序列分析,鉴定该菌株为根霉菌（Rhizopus sp.）。3.培养基中的碳氮源是菌体生长和次生代谢产物累积的主要营养成分,用HPLC检测方法跟踪检测紫杉醇产量,筛选了最佳碳源是葡萄糖,最佳氮源是硝酸铵。通过实验,确定了葡萄糖、硝酸铵的最适浓度,即葡萄糖40.0g/L,硝酸铵6.0 g/L。从而得到发酵培养基组成（g/L）:葡萄糖40.0,NH₄NO₃ 6.0,MgSO₄ 0.3,KH₂PO₄ 0.5,VB1 10×10^-2。4.根据紫杉醇的结构特点和红豆杉中紫杉烷的合成机制,选取赤霉素（GA₃）、茉莉酸甲酯（MeJA）、矮壮素（CCC）、6-苄氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）作为生长调节剂,在发酵第7d加入,采用干重法研究其对LB-5菌体生长的影响,HPLC法跟踪监测紫杉醇产量。实验结果表明,GA₃、MeJA、CCC、6-BA和NAA均可提高紫杉醇的产量。但GA₃、MeJA和CCC对菌丝体的生长有明显的抑制作用;6-BA和NAA对菌丝体的生长均有促进作用。5.GA₃、MeJA、CCC、6-BA和NAA均可提高紫杉醇的产量,针对GA₃、MeJA、CCC、6-BA和NAA的生理作用,分别选取不同的浓度范围,研究其对紫杉醇的产量的影响。结果表明:补加GA₃浓度为4 mg/L时,紫杉醇产量达到最高。此时紫杉醇、BaccatinⅢ和10-DAB的产量分别为670.49μg/L、413.55μg/L和410.94μg/L;补加MeJA浓度为60μmol/L时紫杉醇产量达到最高,此时紫杉醇、BaccatinⅢ和10-DAB的产量分别为838.11μg/L、179.36μg/L和165.31μg/L;补加CCC浓度为25 mg/L时紫杉醇产量达到最高,此时紫杉醇、BaccatinⅢ和10-DAB的产量分别为942.57μg/L、102.35μg/L和98.59μg/L;补加6-BA浓度为4 mg/L时紫杉醇产量达到最大值,此时紫杉醇、BaccatinⅢ和10-DAB的产量分别为455.72μg/L、402.63μg/L和403.91μg/L;补加NAA浓度为4 mg/L时,紫杉醇的产量达到最高,此时紫杉醇、BaccatinⅢ和10-DAB的产量分别为450.46μg/L、408.31μg/L和410.12μg/L。6.随着植物调节剂浓度的增加,生物合成反应向着有利于紫杉醇生成的方向进行,而BaccatinⅢ和10-DAB的产量的随着下降,当它们的浓度达到彼此对紫杉醇所能影响的最大程度时,紫杉醇的产量达到峰值,而BaccatinⅢ和10-DAB的量也达到最低值,当其浓度继续增大时,紫杉醇的产量开始降低,BaccatinⅢ和10-DAB的产量开始增大,由此说明植物调节剂对紫杉醇产量的影响与对BaccatinⅢ和10-DAB的产量的影响呈现反比关系,据此可以印证化学合成中BaccatinⅢ和10-DAB为紫杉醇的前体物质的结论。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
第1章绪论  11-26
  1.1 红豆杉资源  11-12
  1.2 红豆杉的主要化学成分  12-14
    1.2.1 紫杉烷类  12-13
    1.2.2 甾体类化合物  13
    1.2.3 黄酮类化合物  13-14
    1.2.4 倍半萜类化合物  14
    1.2.5 木脂素类化合物  14
  1.3 紫杉醇概述  14-15
  1.4 紫杉醇生物合成路径  15-16
  1.5 紫杉醇工业生产现状  16-20
    1.5.1 直接从红豆杉树木中提取  16-17
    1.5.2 化学半合成及全合成  17-18
    1.5.3 植物细胞离体培养法  18
    1.5.4 基因工程  18-19
    1.5.5 微生物转化法  19
    1.5.6 微生物发酵法  19-20
  1.6 提高内生真菌产紫杉醇产量的途径  20-24
    1.6.1 从自然界筛选高产紫杉醇菌株  21
    1.6.2 利用诱变育种技术进行菌种改良  21
    1.6.3 优化培养基的组成  21-22
    1.6.4 优化发酵条件  22
    1.6.5 添加紫杉醇的合成前体物质  22-23
    1.6.6 添加诱导子  23-24
    1.6.7 添加代谢抑制剂  24
    1.6.8 寻找紫杉醇半合成前体物质的高产菌株并优化培养条件和研究代谢调控  24
  1.7 本论文的主要研究内容  24-26
    1.7.1 代谢产Baccatin Ⅲ和10-DAB 内生真菌的分离  25
    1.7.2 产紫杉烷类物质内生菌定性、定量分析  25
    1.7.3 产紫杉烷类物质内生菌分类鉴定  25
    1.7.4 产紫杉烷类物质内生菌的液体发酵研究  25-26
第2章内生真菌的分离鉴定及代谢产物的检测  26-34
  2.1 材料  26-27
    2.1.1 菌种  26
    2.1.2 培养基  26
    2.1.3 药品与试剂  26-27
    2.1.4 主要仪器  27
  2.2 方法  27-29
    2.2.1 内生真菌的分离、纯化与保藏  27-28
    2.2.2 内生真菌的发酵培养  28
    2.2.3 紫杉烷类物质的提取  28
    2.2.4 紫杉烷类物质含量测定  28
    2.2.5 内生真菌形态观察  28-29
    2.2.6 内生真菌ITS 序列测定  29
  2.3 结果与讨论  29-32
    2.3.1 内生真菌分离  29-30
    2.3.2 内生真菌发酵产物的HPLC 分析  30
    2.3.3 内生真菌的形态特征  30-31
    2.3.4 内生真菌的ITS 序列分析  31-32
  2.4 本章小结与讨论  32-34
第3章紫杉烷类物质的发酵研究  34-39
  3.1 材料  34
    3.1.1 菌种  34
    3.1.2 培养基  34
    3.1.3 药品与试剂  34
    3.1.4 主要仪器  34
  3.2 方法  34-35
    3.2.1 培养方法  34
    3.2.2 紫杉烷类物质的提取及测定方法  34-35
  3.3 结果与分析  35-39
    3.3.1 不同碳源对内生真菌产紫杉烷类物质的影响  35
    3.3.2 不同氮源对内生真菌产紫杉烷类物质的影响  35-36
    3.3.3 不同初糖浓度对内生真菌产紫杉烷类物质的影响  36-37
    3.3.4 不同NH_4NO_3 浓度对内生真菌产紫杉烷类物质的影响  37-39
第4章紫杉烷类物质代谢调控研究  39-47
  4.1 材料  39
    4.1.1 菌种  39
    4.1.2 培养基  39
    4.1.3 药品与试剂  39
    4.1.4 主要仪器  39
  4.2 方法  39-40
    4.2.1 生长曲线的建立  39
    4.2.2 紫杉烷类物质液体发酵  39-40
    4.2.3 紫杉烷类物质分离提取  40
    4.2.4 紫杉烷类物质分析检测  40
  4.3 结果与分析  40-46
    4.3.1 生长曲线的建立  40-41
    4.3.2 植物激素对内生真菌产紫杉烷类物质的影响  41-43
    4.3.3 诱导子对内生真菌产紫杉烷类物质的影响  43-44
    4.3.4 抑制剂对内生真菌产紫杉烷类物质的影响  44-46
  4.4 本章小结与讨论  46-47
结论  47-49
参考文献  49-54
攻读硕士学位期间学术成果  54-55
致谢  55

红豆杉内生真菌代谢产紫杉烷类物质的研究

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