学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

载复合生长因子缓释微球对组织工程心脏瓣膜种子细胞的调控

作　者: 赵堃
导　师: 易定华; 顾春虎
学　校: 第四军医大学
专　业: 外科学
关键词: bFGF PDGF 种子细胞 微球缓释系统 组织工程
分类号: R318.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 37次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


目的:1.找出制备有良好载药率、包封率及载生长因子微球缓释系统的可行方法。2.研究微球缓释系统释药特性,找出促进种子细胞生长所需的生长因子浓度。3.研究载复合生长因子纳米微球缓释系统是否能提高细胞的增殖及分泌能力,促进细胞外基质重构,是否能提高种子细胞在去细胞支架的粘附能力。方法:1.大鼠骨髓间质干细胞的分离、培养及表型鉴定:采用percoll密度梯度离心法对SD大鼠骨髓进行分离培养,应用流式细胞仪测定MSCs细胞周期、及表面抗原CD34、CD44、CD45表型鉴定。2.不同生长因子对MSC增殖、粘附功能影响研究:对MSCs分别加入含浓度为0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 ng·mL-1的bFGF、PDGF或bFGF+PDGF复合生长因子培养基,置于37℃、5% CO2及饱和湿度条件下诱导培养24、48、96、144h。采用CCK-8测定种子细胞增殖情况,计数法测定细胞粘附情况,用流式细胞仪测定细胞周期和凋亡率,检测MSCsⅠ、Ⅲ型胶原分泌情况。最终确定PDGF-BB和bFGF两者之间的最佳浓度比例。3.微球缓释系统的制备:采用改良的乳液聚合法制得一系列粒径DEX-GMA NPs缓释系统（DG-NPs）,并通过对反应条件的优选寻找最佳制备微球的反应条件,选取能达到所需载药量及缓释作用的微球粒径。4.载复合生长因子微球缓释系统对MSC增殖、粘附功能的影响研究:分为bFGF缓释微球组、PDGF缓释微球组、bFGF+PDGF复合缓释微球组分别加入0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 ng?mL-1的bFGF缓释微球、PDGF缓释微球、bFGF+PDGF复合缓释微球至第三代种子细胞,37℃、5% CO2及饱和湿度条件下诱导培养24、48、96、144h,与相应的bFGF、PDGF、bFGF+PDGF及空白组对照,采用计数法测定细胞粘附情况,CCK-8测定种子细胞增殖情况,Weston blot检测MSCsⅠ、Ⅲ型胶原分泌情况。流式细胞仪测定细胞表面抗原特性。结果:1.于大鼠股骨中取得的骨髓间质干细胞经三次传代培养,形态良好,数量可达到107细胞数量级,能满足组织工程种子细胞的需求。2.发现bFGF和PDGF对MSCs的增殖促进作用明显,24 h内3.125 ng·mL-1 bFGF （A值:0.18 0.01）已与空白组（?值:0.12 0.02）产生显著差异（p<0.05）,且在浓度低于100ng?mL-1呈明显浓度依赖趋势。100 ng·mL-1的bFGF和PDGF对MSCs的增殖促进作用最强。同样对于细胞黏附bFGF和PDGF也有明显的促进作用,两者也均呈明显浓度依赖趋势。与同剂量单纯bFGF、PDGF相比bFGF+PDGF复合生长因子对于MSCs的增殖和粘附均有更显著的促进作用（p均<0.01）。3.制备的微球缓释系统,乳化剂与投药量比为1:25,搅拌速率为200 rpm时,改良乳液聚合法制备缓释凝胶微球,微球圆整表面光滑,大小均匀,微球冻干粉为淡白色疏松粉末,包封率88.2 %,初始24h突释达60%,之后持续缓释效果达30 d,且对细胞无毒副作用。4. bFGF缓释系微球与单纯bFGF组对比:24 h浓度25ng·mL-1时对细胞增殖的促进作用bFGF微球组（0.17±0.01）,bFGF组（0.19±0.02）已与空白微球组（0.13±0.02）产生显著差异（p < 0.05）;48h内,bFGF微球组对MSCs增殖促进作用与bFGF组差别无统计意义（p > 0.05）;96h剂量25 ng·mL-1以上时,bFGF微球组对MSCs增殖的促进作用显著高于单纯bFGF组（p < 0.05）。5. PDGF缓释系微球与单纯PDGF对MSCs增殖的对比:培养24h,浓度6.25 ng·mL-1时,PDGF微球组（0.15 0.01）,单纯PDGF组（0.16 0.01）已与空白微球组（0.13 0.02）对细胞增殖的促进作用产生显著差异（p< 0.05）;48h内PDGF微球组对MSCs增殖促进作用与单纯PDGF无显著差异（p> 0.05）;96h剂量6.25 ng·mL-1以上时,PDGF微球组对MSCs增殖的促进作用显著高于单纯PDGF组（p < 0.05）。6. bFGF+PDGF缓释微球促MSCs增殖对比:培养144 h后,50ng·mL-1以上浓度bFGF+PDGF缓释微球组对MSCs的增殖促进作用明显高于非缓释bFGF+PDGF复合因子组（p<0.05）。24、48h,50和100ng·mL-1时,bFGF+PDGF复合缓释微球组对细胞增殖的促进明显高于bFGF缓释微球组（p<0.05）,24h、12.5 ng·mL-1至100 ng·mL-1及48h以上各浓度以及96h和144h低于200 ng·mL-1浓度时,bFGF+PDGF缓释微球组对MSCs的增殖促进效果显著优于单纯PDGF缓释微球组（p < 0.05）。7.缓释微球与非缓释微球组对24h细胞粘附功能的影响:在浓度6.25 ng·mL-1至100 ng·mL-1之间,对于细胞的粘附均有促进作用（p<0.05）,但缓释微球与非缓释微球组对比无显著差异（p>0.05）。bFGF+PDGF复合缓释微球比单纯PDGF和单纯的bFGF缓释微球相比对细胞粘附的影响有显著差异。bFGF+PDGF复合缓释微球组在各时间点对细胞粘附的促进效果显著优于同剂量单纯生长因子微球组（p < 0.05）。8.各生长因子组I型III型胶原分泌的影响:bFGF+PDGF复合缓释微球组I型胶原（26.79 2.58） III型胶原（26.54 1.81）,bFGF+PDGF复合组I型胶原（13.18 2.12）,III型胶原（16.82 1.56）均显著高于相对应的空白微球对照组I型胶原（4.01 0.64） III,型胶原（4.76 0.56）和空白对照组I型胶原（3.16 0.55）, III型胶原（4.72 0.36）（p < 0.01）。同时bFGF+PDGF复合缓释微球组的I型胶原、III型胶原分泌值,也显著高于单纯bFGF+PDGF复合组（p<0.05）。结论:1.本研究制得微球表面光滑圆整,球体大小均匀,我们采取200 rpm搅拌速率获得的微球,平均粒径为20-40μm。并且具有满意的缓释作用及载药量。早期的突释可以使药物快速达到所需峰值浓度,且微球对生长因子的保护性良好,可使生长因子长期持续作用于细胞。2.找到了生长因子bFGF、PDGF与MSCs的增殖与粘附的量效关系,可在组织工程心脏瓣膜的构建过程中根据需要加入复合生长因子DG-NPs,使种子细胞维持分化能力的时期延长,增殖能力提升,I型胶原、III型胶原的泌合成显著增加,细胞粘附力增强。3. bFGF和PDGF缓释微球对MSCs的增值和粘附均有促进作用,96h浓度25 ng·mL-1以上时bFGF微球组对MSCs增殖的促进作用高于bFGF组,96h剂量6.25 ng·mL-1以上浓度PDGF微球组对MSCs增殖的促进作用高于单纯PDGF组。4.复合生长因子缓释微球培养144 h后、50ng·mL-1以上浓度时,bFGF+PDGF缓释微球组对MSCs的增殖促进作用明显高于非缓释bFGF+PDGF复合因子组。同时间各浓度,bFGF+PDGF缓释微球组对MSCs的增殖促进效果均显著优于bFGF缓释微球;24h、12.5 ng·mL-1浓度以上,以及48h以上各浓度bFGF+PDGF缓释微球组对MSCs的增殖促进效果显著优于单纯PDGF缓释微球组。5. bFGF+PDGF复合生长因子微球与单纯PDGF和单纯的bFGF缓释微球相比对细胞粘附的影响有显著差异。bFGF+PDGF复合缓释微球组在各时间点对细胞粘附的促进效果均显著优于同剂量单纯生长因子微球对照组。6. bFGF+PDGF复合缓释微球组、单纯bFGF+PDGF复合组的I型胶原、III型胶原分泌均显著高于相对应的空白微球组和空白组。同时bFGF+PDGF复合缓释微球组的I型胶原、III型胶原分泌,也显著高于单纯bFGF+PDGF复合组。

全文目录


缩略语表  6-7
中文摘要  7-12
Abstract  12-18
前言  18-21
文献回顾  21-34
  一、组织工程心脏瓣膜的研究现状  21-25
  二、细胞因子的作用与细胞外基质和微环境的重建  25-27
  三、载药微球缓释系统的应用  27-34
实验一 大鼠骨髓间质干细胞 MSCs 的分离、培养及表型鉴定  34-40
  1 实验材料  34-35
  2 实验方法  35-37
  3 实验结果  37-38
  4 讨论  38-40
实验二 不同生长因子对 MSC 增殖粘附功能的影响  40-46
  1 实验材料  40
  2 实验方法  40-42
  3 实验结果  42-43
  4 讨论  43-46
实验三 改性葡聚糖(Dex-GMA)微球的设计与合成  46-53
  1 实验材料  46
  2 实验方法  46-50
  3 实验结果  50-51
  4 讨论  51-53
实验四 载复合生长因子微球缓释系统对 MSC 增殖、粘附功能的影响  53-62
  1 实验材料  53-54
  2 实验方法  54-58
  3 实验结果  58-60
  4 讨论  60-62
结论  62-64
附图  64-72
附表  72-79
个人简历及研究成果  79-80
致谢  80

相似论文

  1. 酸溶液对壳聚糖/羟基磷灰石复合材料的结构与性能的影响研究,R318.08
  2. 组织工程化类金刚石涂层瓣膜构建及其体内植入的初步研究,R654.2
  3. 人皮肤成纤维细胞搅拌培养和保存的初步研究,R329
  4. 碱性成纤维细胞生长因子联合局部氧疗促进烧伤创面愈合的临床研究,R644
  5. 兔脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞成软骨能力的比较,R329
  6. ROCKⅠ对PDGF介导血管平滑肌细胞迁移分子机制的研究,R363
  7. ROCK表达下调对PDGF介导的血管平滑肌细胞迁移、增殖的调控,R363
  8. bFGF对鼠脑缺血/再灌注皮质区p-Akt（Ser473）、Fractalkine表达的影响,R743.3
  9. 硅油填充继发青光眼患者前房液中生长因子含量变化的相关分析,R779.6
  10. 丝素微球的制备及其作为细胞载体的研究,R318.08
  11. 超顺磁氧化铁纳米粒介导bFGF转染猫角膜内皮细胞,R77
  12. 静电纺丝素/聚丁二酸丁二醇酯血管材料结构与性能的研究,R318.08
  13. 组织工程复合电纺支架的制备与性能研究,Q813
  14. 碳纳米管在聚合物纳米纤维表面的组装及其细胞活性评价,R318.08
  15. bFGF壳聚糖微球的制备及其促雪旺细胞分裂增殖的研究,R651.2
  16. 大鼠牙囊细胞分离培养及生物学特性的体外研究,R780.2
  17. 丹参联合骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死区血管新生的影响,R542.22
  18. 新型生物传感技术用于核酸和蛋白质的检测,Q52
  19. 人角膜上皮细胞系的鉴定与组织工程人角膜上皮体外重建的研究,R770.2
  20. 碱性成纤维细胞生长因子对环磷酰胺致小鼠生精功能损害促修复作用及其机制的研究,R73-3
  21. 肿瘤细胞诱导巨噬细胞产生促瘤功能,R730.2

中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医用一般科学 > 生物医学工程 > 人工脏器与器官 > 心脏血管系
© 2012 www.xueweilunwen.com