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缓释PDGF-BB的纳米珍珠层/聚乳酸/纤维蛋白胶复合支架的实验研究

作　者: 肖文德
导　师: 陈建庭
学　校: 南方医科大学
专　业: 骨外科学
关键词: 纳米珍珠层聚乳酸纤维蛋白胶血小板衍生生长因子-BB 生物活性
分类号: R318.08
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究背景：创伤、肿瘤切除以及感染等多种原因均可导致骨缺损。骨缺损修复一直是临床骨科医师所面临的一项难题。目前,临床上常用的修复方法,如自体骨移植、异体骨移植均存在不足之处,难以满足临床上治疗的需要。随着骨组织工程技术的兴起和快速发展为骨缺损的修复重建提供了崭新的思路。珍珠层是软体动物珍珠贝科或蚌科动物的贝壳内层部分,一般由95%的文石型CaCO3晶体和5%的有机质组成,是一种天然的无机有机层状生物复和材料。珍珠层中的有机质主要含有蛋白和多糖等大分子物质。研究表明,珍珠层作为生物替代材料具有其它无机材料无法比拟的优势,它是一种来源于生物体的材料,来源丰富,成本低廉,加工简易,理化性质及生物学特性与动物及人类骨组织非常接近。法国科学家Lopez等首次在体外研究证实珍珠层具有诱导造骨细胞活化成骨的作用,其后相关的研究证实珍珠层是一种新型的可降解生物活性材料,它不仅具有很好的生物相容性,而且同时具有骨传导作用和潜在骨诱导性,与现有的临床所用的各种骨植入材料相比具有无比的优越性,是一种很有前途的骨植入材料。随着人们对支架材料性能要求的进一步提高,单相的生物支架材料已经难以满足临床的要求,因而将不同性质的材料进行复合以获取优良临床性能的复合生物材料已经成为当前材料领域研究的热点。有机高分子聚合物材料聚乳酸(Poly-lactide acid, PLA),具有良好的生物相容性、可降解吸收性,聚乳酸作为新型生物可降解材料在生物医学应用方面占据着重要地位。其中,消旋聚乳酸(Poly-D,L-lactide acid, PDLLA)降解和吸收速度较快,更适宜选作骨替代材料。尽管聚乳酸具备诸多优点,但它存在高疏水性、细胞亲和性差、机械强度不足和产物易引起炎症反应等缺点使其应用受限。由于珍珠层的主要成分是CaC03晶体,具有一定的碱性、力学性能较好,与聚乳酸复合可弥补各自的缺点。因此,本课题组早期采用自行设计的“模压增强法”专利技术制作珍珠层／聚乳酸复合人工骨。经过一系列的体内外研究,均证实了这种复合材料具有良好的生物相容性和成骨能力；与此同时,我们也发现珍珠层的生物降解缓慢,降解速度与新生骨的生长速度不成比例。近年来人们对纳米材料的研究,取得了广泛的进展。为此,本着如何改善珍珠层人工骨降解性能和保持其生物学活性的目的,本课题组试图探讨纳米珍珠层人工骨在生物学领域应用。我们利用行星式球磨机制备纳米级珍珠层粉,然后将纳米级珍珠层粉与消旋聚乳酸复合,按照溶剂浇铸、热压铸模、溶质沥滤的工序,制成纳米珍珠层人工骨,初步研究表明纳米珍珠层人工骨原材料粒径小,有利于降解吸收,并具有良好的生物相容性及生物活性。由于纳米珍珠层与消旋聚乳酸混合制备人工骨材料,总体上降低了珍珠层的含量,从而降低了人工骨的潜在骨诱导性；加上我们课题组系列前期研究证实PDGF-BB可以加速骨缺损的修复,同时促进破骨细胞的骨吸收功能,在调节骨组织改建中发挥重要作用。因此,我们在改善复合支架材料理化性能的基础上尝试将PDGF-BB与纳米珍珠层／聚乳酸支架复合,增强其骨诱导性,从而促进其修复骨缺损的能力。本实验研究是在上述仿生的思路下和本课题组前期研究的基础上,采用粒子沥滤-模压成型-冷冻干燥技术制备缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架,并对支架的理化性能、力学性能、生物相容性和成骨能力进行综合评价,为新材料的临床应用提供实验依据。目的：1.探讨缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架的制备方法及其性能；2.观察缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架材料对MC3T3-E1粘附、增殖及分化等生物行为的影响；3.探讨缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架材料的动物体内生物相容性和使用安全性；4.探索将缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架植入兔桡骨15mm临界性骨缺损,观察其体内成骨情况及修复骨缺损的效果。方法：1.缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架的制备及表征(1)纳米珍珠层粉的制备以海水珍珠层粉为原料,利用行星式球磨机制备纳米级珍珠层粉,对所得珍珠层粉采用超高分辨率场发射扫描电子显微镜进行检测和X射线衍射分析。(2)缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架的制备采用溶剂浇铸-粒子沥滤法制备聚乳酸支架(S1支架)和纳米珍珠层／聚乳酸支架(S2支架),接着将PDGF-BB与纤维蛋白胶混合注入S2支架,冷冻干燥后制成缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架(S3支架)。三种支架通过万能测试机测试抗压强度、扫描电子显微镜观察表面形貌以及阿基米德法测定孔隙率,对以上检测结果进行对比分析；利用ELISA法检测S3支架降解过程中PDGF-BB释放量。2.缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架的细胞相容性将MC3T3-E1细胞分别接种聚乳酸支架(S,支架组)、纳米珍珠层／聚乳酸支架(S2支架组)和缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架(S3支架组),单纯细胞培养为空白对照组。在倒置相差显微镜下观察MC3T3-E1细胞贴附情况,在扫描电子显微镜下观察MC3T3-E1细胞在材料上生长情况,沉淀法和MTT法检测MC3T3-E1细胞的粘附和增殖情况,碱性磷酸酶试剂盒测定细胞碱性磷酸酶活性变化,茜素红钙结节染色观察MC3T3-E1细胞矿化能力的变化。3.缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架的组织相容性(1)将制备好的缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架放入生理盐水中获取材料浸取液,然后进行急性全身毒性试验、皮内刺激试验以及热原实验。(2)动物体内筋膜下植入试验：取新西兰大白兔12只,在兔皮下筋膜组织中植入聚乳酸支架(S1支架组)、纳米珍珠层／聚乳酸支架(S2支架组)和缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架(S3支架组)。分别于术后1、4、8、12周分别行X-ray检查,取材后行HE染色、光学显微镜下观察组织反应情况。4.缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架的成骨能力(1)实验分组体重2-3kg的成年雄性新西兰大白兔36只,随机分为4组,两侧桡骨制造15mm骨缺损。分别植入聚乳酸支架(S1支架组),纳米珍珠层／聚乳酸支架(S2支架组)和缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架(S3支架组),不植入支架材料的为空白对照组。(2)兔桡骨临界性骨缺损模型的建立手术过程：动物麻醉后,备皮、消毒、铺中,沿桡骨干长轴方向切开皮肤、皮下组织、深筋膜,钝性分离肌肉,骨膜剥离器剥离骨膜,暴露桡骨中段,手持式电动摆锯截取兔双侧桡骨中段,造成约15mm骨和骨膜节段性骨缺损模型,按组别分别将各组支架材料放置于骨缺损部位。(3)取材及观察指标在植入支架材料后4,8,12周观察各组实验动物饮食、活动及伤口愈合等大体情况,以及骨缺损部位X射线变化,并取材行大体观察、Micro-CT扫描重建、骨密度测量和组织学观察。结果：1.X射线衍射分析结果表明所选样品96%为文石型CaC03,平均粒度为70.3nm。超高分辨率场发射扫描电子显微镜测试表明珍珠层粉中的文石颗粒粒径45-95nm,颗粒大小不等,存在团聚现象。成功制得S1支架,S2支架和S3支架三种材料,均为3.5mmx3.5mm×15mm和8mm×8mm×l5mm的实心圆柱体。2.通过电镜观察,S1支架,S2支架和S3支架三种材料,均具有良好的三维多孔结构,孔径分别为(330.0±55.6)μm、(322.5±50.8)μm和(303.3±47.0)μm,差异无统计学意义(P=0.141)；采用阿基米德法测定孔隙率分别为81.0±1.1%、82.5±0.8%和80.2±0.7%,差异无统计学意义(P=0.211)；生物力学测试结果显示抗压强度分别为(3.6±0.12) MPa、(5.0±0.35) MPa和(5.1±0.26)MPa, S1与S2和S3有显著性差异(P<0.001)。 ELISA实验结果表明S3支架中复合的PDGF-BB释放长达30d,呈持续缓慢释放。3. MC3T3-E1细胞在S3支架上能良好的粘附、增殖,并向支架孔内生长,明显优于S1和S2支架。培养4h和24h后S3支架组细胞粘附率均显著高于S1和S2支架组,差异均有统计学意义(P<0.001)。 MTT检测MC3T3-E1在各组中均生长良好,4值均随时间延长而增大,同组各时间点比较,差异均有统计学意义(P<0.05);各时间点组间比较,S3支架组与其余三组比较差异有统计学意义(P<0.001)。各组ALP活性在第7d时达到最高峰,各时间点细胞ALP活性表达S3组最高,与其余各组比较有显著性差异(P<0.001)。支架材料与MC3T3-E1细胞共培养3周后,经茜素红染色,可见大小不一、形态各异的红色结节,与S1支架组、S2支架组和空白对照组相比, S3支架组的矿化结节数目和面积明显增加。4.通过急性全身毒性试验、皮内刺激试验、热原试验和动物皮下植入试验表明,缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架材料无毒性作用,不引起皮内刺激反应,不具有致热原作用,体内植入后无明显组织反应,符合相应标准要求,具有良好的生物安全性。5.一般情况：术后所有动物伤口愈合良好,未发生骨折,活动进食情况和精神状态基本正常。X线检查：S3支架组在术后4周时截骨端及缺损区有密度较低的骨痂形成,缺损区部分为骨痂填充；术后8周时骨缺损处己有大量新生骨所填充,两断端间形成桥接,可见部分髓腔再通；术后12周时骨缺损处完全为新生骨桥接,密度较均一,骨缺损基本完全愈合,髓腔再通；各时间点Lane-Sandhu X线评分,S3支架组均优于S2支架组,有显著性差异(P<0.05)；S2支架组优于S1支架组和空白对照组,有显著性差异(P<0.05)。骨密度测量：各时间点S3支架组的骨密度显著高于S1与S2支架组,有显著性差异(P<0.001),12周时S3支架组的骨密度值与正常值无显著性差异(P>0.05)。大体标本观察：术后12周时S3支架组材料完全被骨痂包裹,界限消失,不易分辨出骨缺损端,皮质完全连接；S2支架组可见断端出现骨性连接,修复尚不完全；S,支架组仅尺侧有少量骨相连,空白对照组骨缺损清晰可见。Micro-CT扫描重建：术后12周S1支架组重建后只能看到零星的新生骨结构；S2支架组重建后可见形成的新骨结构不规则,部分骨缺损未能修复；S3支架组重建后可见形成的新骨结构连续、完整、规则,骨缺损基本完全修复；空白对照组未见成骨,桡骨保持了骨缺损状态。组织学检查：S3支架组术后4周,骨断端与支架材料结合部、支架材料内部均可见少量的新生软骨,有类骨样组织出现,支架结构较完整,可见纤维结缔组织长入,并有少量血管存在；术后8周,骨缺损处新生骨组织增多,出现成熟的骨细胞和编织骨,支架材料部分降解,内部有血管生成；术后12周,新生骨逐渐改建,骨断端与材料界限不清,两者以大量的编织骨或成熟的板层骨连接,髓腔再通。结论：1.缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架材料具有高孔隙率、合适的孔径和孔与孔之间的贯通性,其生物力学特性达到了组织工程对支架材料的性能要求,并且持续缓慢释放PDGF-BB。2.缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架材料属于无细胞毒性的生物材料,具有良好的生物相容性,有利于MC3T3-E1细胞的粘附与生长,并且在一定程度上促进MC3T3-E1细胞的分化和矿化。3.缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架材料无毒性作用,不引起皮内刺激反应,不具有致热原作用,体内植入后无明显组织反应,具有良好的生物安全性,符合作为骨组织工程材料基本条件。4.体内、外实验证实缓释PDGF-BB的纳米珍珠层／聚乳酸／纤维蛋白胶复合支架具有良好的骨传导作用和骨诱导性,是一种成骨活性良好的骨缺损修复材料。

全文目录

摘要  3-10
ABSTRACT  10-20
前言  20-26
  参考文献  22-26
第一部分缓释PDGF-BB的n-Nacre/PDLLA/FG复合支架的制备及表征  26-46
  材料与方法  26-30
  结果  30-34
  附图  34-37
  讨论  37-41
  结论  41-42
  参考文献  42-46
第二部分缓释PDGF-BB的n-Nacre/PDLLA/FG复合支架的细胞相容性研究  46-66
  材料与方法  46-52
  结果  52-57
  附图  57-59
  讨论  59-62
  结论  62-63
  参考文献  63-66
第三部分缓释PDGF-BB的n-Nacre/PDLLA/FG复合支架的体内生物相容性研究  66-83
  材料与方法  66-72
  结果  72-75
  附图  75-77
  讨论  77-80
  结论  80
  参考文献  80-83
第四部分缓释PDGF-BB的n-Nacre/PDLLA/FG复合支架修复临界性骨缺损的实验研究  83-107
  材料与方法  83-88
  结果  88-93
  附图  93-98
  讨论  98-102
  结论  102
  参考文献  102-107
全文总结  107-108
综述  108-122
  参考文献  116-122
攻读学位期间的成果  122-124
中英文对照缩略词表  124-126
学位论文统计学审查合格证书  126-127
致谢  127-129

缓释PDGF-BB的纳米珍珠层/聚乳酸/纤维蛋白胶复合支架的实验研究

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