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银屑病皮损NF-κB，IL-6，p16，DNMT1和HDAC1表达及共表达研究

作　者: 邵依
导　师: 李红文
学　校: 郑州大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: NF-κB IL-6 P16 DNMT1 HDAC1 寻常性银屑病
分类号: R758.63
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

背景和目的银屑病是一种常见并且容易复发的慢性炎症性皮肤病,有表皮过度增生和血管增殖。银屑病的发病机制复杂,病因未明确,是当前皮肤科领域内重点研究的疾病之一。目前国内外多认为,银屑病是具有遗传易感基因的个体在内外界环境因素作用下,T细胞介导的炎症性皮肤病。NF-κB (nuclear factor-κB)是一种真核细胞转录因子,位于活化的T细胞信号转导通路末端,是重要的桥梁,紧密连接被活化的T细胞和银屑病相关炎症介质的转录。IL-6是一种重要的炎症介质,能通过对内皮细胞的影响参与炎症反应,可引起自身抗原提呈异常而触发自身免疫反应,可促进角质形成细胞及T细胞增殖和活化,且和银屑病的严重程度相关。P16基因是一种抑癌基因,主要参与细胞周期调控,在细胞增殖负性调节中起重要作用。已有报道表明,表观遗传调控机制在系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病和肿瘤的发生发展中起到重要作用。已有研究表明表观遗传调控参与了银屑病的发病机制,但表观遗传调控在银屑病的发病机制中的作用尚未十分明确。表观遗传调控是指在DNA序列没有发生变化的情况下,基因的异常表达调控了可遗传的变化,包括细胞的生长、分化、增殖以及凋亡。表观遗传调控机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和microRNA调控。DNA甲基化是最早发现的表观遗传的修饰途径之一,能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA和蛋白质相互作用方式的变化,从而调节和控制基因表达。DNA甲基化可以沉默某些基因的表达,而低甲基化则能够诱导某些基因的表达。现在国内外已有报道发现大量肿瘤抑制基因失活与该基因启动子区域的过度甲基化有密切的直接联系。与此相反,低甲基化会导致某些在正常状态下受到抑制的基因如癌基因过度表达,从而导致癌症的发生。参与DNA甲基化重要的酶就是DNA甲基化修饰酶DNMTs。组蛋白修饰是另一种重要的表观遗传调控机制。组蛋白是真核生物体细胞染色质中的碱性蛋白质,包括H1、H2A、H2B、H3、H4共5种。其中除H1外,其余4种组蛋白均以二聚体相结合,共八聚体,组成核小体核心,DNA围绕在核小体的核心,H1与核小体间的DNA结合。核小体是构成染色质的基本单位。组蛋白翻译完成后,八聚体的氨基N末端富含疏水氨基酸,能够发生多种共价修饰。这些共价修饰可以相互联合或者被其他的蛋白酶或复合体等识别和结合,进而发挥作用,为促进或抑制基因表达的染色质相关蛋白提供可结合的位点。目前研究较多的组蛋白修饰是组蛋白乙酰化。组蛋白乙酰化与基因的活化、DNA复制相关,而组蛋白去乙酰化和基因的失活相关。组蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferases,HATs)将乙酰基转运至组蛋白H3、H4的氨基N末端,而组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)有着恰恰相反的作用。MicroRNA是最近几年在真核生物中发现的一种参与基因转录后调控的非编码小分子RNA。它通过与目的靶mRNA的碱基序列的配对,进而导致目的基因翻译的抑制和基因表达的沉默。在此基础上探讨银屑病皮损的NF-κBJL-6, P16的表达水平及各与DNMT1或HDAC1的共表达的关系。材料与方法1.临床资料收集我院2011年2月至2011年8月皮肤科门诊寻常型银屑病患者30例,均经组织病理学确诊。其中男22例,女8例,年龄15-49岁,平均年龄(29.21±14.93)岁,病程(11.25±6.21)年,PASI评分为(28.68±14.52)分。有家族史的12例。收集我院2011年7月至8月泌尿外科包皮切除术患者30例,年龄22岁-38岁,平均年龄(31.91±6.24)岁。本研究经我院伦理委员会批准,患者均签署知情同意书。2.标本的处理所有标本均置于4%多聚甲醛固定,常规制备为石蜡包埋的切片。标本在脱蜡入水过程中,分别进行以5mmol/L左旋咪唑/95%乙醇,处理20min消除内源性碱性磷酸酶,以3%H202/D.H20处理20min以消除内源性过氧化物酶。应用NF-κB鼠单抗,,IL-6鼠单抗,p16鼠单抗,DNMT1兔多抗和HDAC1羊多抗对皮损和正常组织进行NF-κB, IL-6,P16以AEC为底物的免疫组化单染色,和HDAC1或DNMT1以NBT-BCIP为底物的免疫组化的单染色。DNMT1或HDAC1分别与NF-κB,IL-6,P16的免疫组化的双染色。皮损和正常组织标本同时以正常血清封闭后,分别用PBS以1：100稀释的单抗及多抗混合4℃孵育过夜,先进行单抗的AEC染色后,再进行多抗的NBT-BCIP染色,水洗,终止反应。同时进行以PBS代替一抗的阴性对照。采用免疫组化法检测30例寻常性银屑病和30例包皮环切术皮损中NF-κB, IL-6,P16及各与DNMT1或HDAC1的表达和共表达,并利用计算机图像采集与分析系统对免疫组化结果进行平均光密度测定,分析各自表达水平及共表达定位的关系。3.统计学方法本研究计量资料以x±s表示,两组间比较采用t检验,组内深浅层比较采用配对t检验,检验为双侧检验,P<0.05为差异具有统计学意义。所有统计学分析采用SPSS(statistical Product and Service Solutions)17.0软件进行处理。结果以AEC酶底物的免疫组化单染信号呈红棕色,皮损组表皮细胞增殖旺盛,表现为棘细胞体积增大变圆,层次增多。正常组基底层细胞呈立方形,胞质内可见黑棕色的色素颗粒；两组的角质层呈匀质粉色。单染的皮损组NF-κB及IL-6的表达显著高于正常组(P<0.05),且可见胞核呈阳性信号；皮损组P16的表达显著低于正常组,P<0.05。以NBT-BCIP为底物的DNMT1或HDAC1单染色信号呈蓝色,皮损组与正常组相比差异并不明显(P>0.05)。但当IL-6, NF-κB,P16各与DNMT1或HDAC1双染时,信号则呈深浅不同的蓝紫色或粉紫色,皮损组DNMT1或HDAC1的共表达信号在棘细胞浅层比深层更强,P<0.05；更强于正常对照组。同时进行以PBS代替一抗的阴性对照标本,表达信号呈阴性。结论1、银屑病皮损的NF-κB, IL-6的高表达及P16的低表达参与银屑病发病机制；2、皮损组P16,NF-κB, IL-6的表达异常可能与表观遗传调节酶(DNMT1和HDAC1)的表达异常有关,DNMT1和HDAC1沉默P16的表达,参与细胞增殖。3、共表达的DNMT1或HDAC1的高表达主要定位于棘细胞浅层,提示棘细胞浅层可能参与银屑病的表观遗传调节。

全文目录

摘要  4-8
Abstract  8-14
中英文縮略词对照表  14-15
前言  15-17
资料和方法  17-20
  1. 临床资料  17-18
  2. 方法  18-19
  3. 统计学数据分析  19-20
结果  20-24
讨论  24-28
  1. NF-κB、IL-6及P16在银屑病皮损中的表达  24-25
  2. 银屑病皮损的NF-κB,IL-6, P16各与DNMT1/HDAC1共表达的关系  25-28
结论  28-29
参考文献  29-31
综述部分银屑病的病因研究  31-57
  参考文献  50-57
个人简历  57-58
在学期间发表的学术论文与研究成果  58-59
致谢  59

银屑病皮损NF-κB，IL-6，p16，DNMT1和HDAC1表达及共表达研究

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