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芸香苷对人晶体上皮细胞氧化损伤和凋亡保护作用及相关基因表达的研究

作　者: 喻亚梅
导　师: 周艳峰
学　校: 安徽医科大学
专　业: 眼科学
关键词: 晶体上皮细胞 芸香苷 过氧化氢 氧化损伤 凋亡基因
分类号: R776.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的国内外研究一直认为，氧化损伤是各种原因诱发年龄相关性白内障的共同作用机制，晶状体上皮细胞（LEC）凋亡是所有非先天性白内障发生得共同通路。年龄相关性白内障LEC中Bcl-2基因表达为阴性，而Bax, Caspase-3表达为阳性。本课题以此为理论依据，研究黄酮类化合物芸香苷（Ru）对过氧化氢（H2O2）诱导的人晶状体上皮细胞（HLEC）氧化损伤和凋亡的保护作用及Ru对相关凋亡基因Bcl-2,Bax, Caspase-3转录水平表达的影响。方法（1）正常培养的SRA01-04系HLEC，分别加入不同浓度的Ru和H2O2，共同培养24h，MTT法检测各组细胞生存活力，以确定有效的Ru和H2O2实验浓度。（2）用浓度为0,25,50,100μmol/L的Ru预处理HLEC1h，再分别加入200μmol/LH2O2共同培养24h，MTT法检测Ru对各预处理组细胞增殖活性的影响。（3）收集各组细胞裂解液，比色法检测超氧化物歧化酶（SOD）活性，酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测还原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）含量。（4）制作细胞爬片，TUNEL法染色各组凋亡细胞，观察细胞凋亡形态并计算凋亡指数（AI）。（5）收集各组细胞提取总RNA，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术检测各组细胞Bcl-2, Bax, Caspase-3mRNA水平表达。结果（1）实验发现，H2O2浓度在200μmol/L时接近细胞生存半数抑制率（IC50），因此选择200μmol/L H2O2作为H2O2组实验浓度。（2）浓度小于100μmol/L的Ru对细胞增殖能力无显著性影响；选择25,50,100μmol/L的Ru分别作为Ru低剂量组、Ru中剂量组和Ru高剂量组浓度进行实验。（3） H2O2组HLEC增殖能力，SOD,GSH含量较对照组显著下降、MDA和AI较对照组明显增高（P＜0.01）；Bcl-2基因表达明显下调，Bax, Caspase-3基因表达明显上调（P＜0.05）。（4）Ru（25,50,100μmol/L）预处理组与H2O2组相比，细胞生存率，抗氧化水平明显提高，凋亡细胞数量显著减少（P＜0.01）；Bcl-2基因表达量较H2O2组有所增加，Bax, Caspase-3基因表达明显减少（P＜0.05）。结论Ru可以提高HLEC增殖能力，保护H2O2诱导HLEC的氧化损伤和凋亡，其机制可能与Ru能够上调Bcl-2基因表达，下调Bax基因、Caspase-3转录水平的表达有关。

全文目录


英文缩略语  6-8
中文摘要  8-10
Abstract  10-12
1 前言  12-15
2 材料与方法  15-26
  2.1 材料  15-18
    2.1.1 实验细胞  15
    2.1.2 主要药品及试剂  15-16
    2.1.3 仪器设备  16
    2.1.4 主要溶液配制  16-18
  2.2 方法  18-25
    2.2.1 细胞培养  18
    2.2.2 细胞处理与分组  18-19
    2.2.3 MTT 检测细胞活力  19
    2.2.4 检测 SOD, GSH, MDA 含量  19-21
    2.2.5 TUNEL 法检测细胞凋亡  21-23
    2.2.6 RT-qPCR 技术检测 Bcl-2, Bax 及 Caspase-3 mRNA 水平表达  23-25
  2.3 统计学处理  25-26
3 实验结果  26-37
  3.1 H_2O_2最佳实验浓度选择  26-27
  3.2 Ru 对 HLEC 细胞活力的影响  27-28
  3.3 Ru 对 H_2O_2诱导的细胞毒性保护作用  28-29
  3.4 Ru 对 HLEC 中 SOD, GSH 和 MDA 含量的影响  29-31
  3.5 Ru 对 H_2O_2诱导的细胞凋亡抑制作用  31-32
  3.6 Ru 对 HLEC Bcl-2, Bax 及 Caspase-3 mRNA 水平表达的影响  32-37
    3.6.1 实时荧光定量 PCR 扩增结果  32-34
    3.6.2 各组 HLEC 中 Bcl-2 基因 mRNA 相对表达量  34-35
    3.6.3 各组 HLEC 中 Bax 基因 mRNA 相对表达量  35-36
    3.6.4 各组 HLEC 中 Caspase-3 mRNA 相对表达量  36-37
4 讨论  37-42
5 结论  42-43
参考文献  43-47
附录  47-48
致谢  48-49
综述  49-59
  参考文献  56-59

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中图分类: > 医药、卫生 > 眼科学 > 晶状体与玻璃体疾病 > 白内障
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