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IL-33在β-淀粉样蛋白刺激视网膜色素上皮细胞中的表达及作用机制研究
作 者: 刘晓萃
导 师: 何守志
学 校: 中国人民解放军军医进修学院
专 业: 眼科学
关键词: IL-33 视网膜色素上皮细胞 炎症因子 年龄相关性黄斑变性 发病机制
分类号: R774.1
类 型: 博士论文
年 份: 2012年
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内容摘要
目的:1.本课题以IL-33作为主要研究对象,研究其在β-淀粉样蛋白(Aβ)刺激人视网膜色素上皮细胞中的表达特性。2.初步探明IL-33在人视网膜色素上皮细胞中的作用及机制。方法:1. IL-33在β-淀粉样蛋白刺激人视网膜色素上皮细胞中的表达特性研究采用MTT法检测不同浓度Aβ1-40刺激D407细胞后不同时间点的细胞存活率,观察其对视网膜色素上皮细胞损伤的影响。提取不同浓度Aβ1-40刺激D407细胞24h后细胞RNA,采用定量PCR检测IL-33mRNA水平;收集细胞培养上清,ELISA检测IL-33蛋白表达;加入NF-κB,ERK1/2,JNK,p38MAPK信号通路抑制剂后,采用定量PCR及ELISA检测0.3μMAβ1-40刺激D407细胞24h后IL-33mRNA及蛋白水平表达,鉴定β-淀粉样蛋白刺激视网膜色素上皮细胞后调控产生IL-33的信号通路。2. IL-33在人视网膜色素上皮细胞中的作用及机制研究采用定量PCR检测不同浓度的IL-33刺激D407细胞16h后其受体ST2LmRNA表达情况,流式细胞术检测100ng/ml IL-33刺激D407细胞16h后细胞表面受体ST2L表达;不同浓度的IL-33刺激D407细胞16h后,收集细胞及培养上清,定量PCR和ELISA检测炎症因子IL-6,IL-8,IL-1β,TNF-α mRNA和蛋白表达,探讨IL-33因子对D407细胞的作用机制;加入NF-κB,ERK1/2,JNK,p38MAPK信号通路抑制剂后,采用定量PCR及ELISA检测100ng/ml IL-33刺激D407细胞16h后上述炎症因子的表达,鉴定调控产生炎症因子的信号通路。结果:1. IL-33在β-淀粉样蛋白刺激人视网膜色素上皮细胞中的表达特性研究1.10.3μM Aβ1-40刺激组较正常组细胞形态变圆,胞体肿胀,细胞排列数量减少,细胞间间隙增加,且随Aβ1-40刺激浓度增加变化明显,而小于0.3μM Aβ1-40刺激组细胞形态无明显变化。MTT检测结果表明:随着Aβ1-40刺激浓度的增加,细胞存活率逐渐下降,除了0.001μMAβ1-40刺激组外,其余各刺激组与正常对照组相比细胞存活率均显著降低(P <0.05)。随着0.3μM和1μM Aβ1-40刺激D407细胞时间的延长,细胞存活率也逐渐下降,且与对照组相比均有显著性差异(P <0.05)。1.2不同浓度Aβ1-40刺激D407细胞后,IL-33mRNA及蛋白表达水平均增加,且在0.3μM刺激浓度时表达显著增加(P <0.05)。结果提示:Aβ1-40刺激D407细胞后能够引起IL-33表达上调。1.3加入ERK1/2和p38MAPK信号通路抑制剂,0.3μM Aβ1-40刺激D407细胞24h后,IL-33mRNA表达水平显著降低(P <0.05),但只有加入ERK1/2信号通路抑制剂后,细胞培养上清IL-33蛋白水平才有明显下降(P <0.05)。结果提示:Aβ1-40刺激D407细胞后,IL-33的产生主要是通过ERK1/2信号通路调控,而p38MAPK信号通路仅参与了IL-33转录水平的调控。2. IL-33在人视网膜色素上皮细胞中的作用及机制研究2.1IL-33因子刺激D407细胞后,ST2L mRNA表达显著增加(P <0.05),并随着IL-33刺激浓度的增加而增加,且在100ng/ml IL-33刺激时表达量最高。采用流式细胞术检测D407细胞表面受体表达结果显示:D407细胞表面ST2L表达阳性,且在100ng/ml IL-33因子刺激细胞16h后表达上调。2.2采用定量PCR及ELISA检测IL-33因子刺激D407细胞后炎症因子IL-6,IL-8,IL-1β,TNF-α mRNA及蛋白水平表达。结果显示:20,50,100ng/ml IL-33刺激D407细胞16h后,炎症因子mRNA及蛋白水平表达均显著增加(P <0.05),且随着IL-33因子刺激浓度的增加,炎症因子表达均逐渐增加,并在100ng/mlIL-33刺激时表达量最高。结果提示:IL-33刺激D407细胞后IL-6,IL-8,IL-1β,TNF-α因子表达上调。2.3加入NF-κB,ERK1/2,JNK,p38MAPK信号通路抑制剂,100ng/ml IL-33刺激D407细胞16h后,定量PCR和ELISA检测炎症因子mRNA及蛋白水平表达,结果显示:加入p38MAPK信号通路抑制剂后,IL-6表达显著下降;加入ERK1/2信号通路抑制剂后,IL-8表达显著下降;加入NF-κB信号通路抑制剂后,IL-1β表达显著下降;而加入JNK信号通路抑制剂后,TNF-α表达显著下降(P <0.05)。结果表明:IL-33因子刺激D407细胞后炎症因子IL-6,IL-8,IL-1β,TNF-α的产生是分别通过p38MAPK,ERK1/2,NF-κB以及JNK信号通路调控。结论:1.随着Aβ1-40刺激浓度的增加和时间的延长,人视网膜色素上皮细胞存活率逐渐下降。2. β-淀粉样蛋白1-40刺激人视网膜色素上皮细胞后能够诱导IL-33因子转录及蛋白水平表达上调,且IL-33的产生主要是通过ERK1/2信号通路调控,而p38MAPK信号通路仅参与了IL-33转录水平的调控。3.人视网膜色素上皮细胞表面表达ST2L受体且随着IL-33因子刺激浓度的增加ST2L表达量增加。4. IL-33刺激人视网膜色素上皮细胞后能够上调炎症因子IL-6,IL-8,IL-1β,TNF-α的表达。5.在人视网膜色素上皮细胞中,IL-33因子分别通过p38MAPK,ERK1/2,NF-κB,JNK信号通路调控炎症因子IL-6,IL-8,IL-1β,TNF-α的表达。
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全文目录
英文缩略表 6-8 中文摘要 8-11 Abstract 11-14 前言 14-20 参考文献 16-20 第一部分 IL-33 在β-淀粉样蛋白刺激人视网膜色素上皮细胞中的表达研究 20-41 引言 20 实验一 Aβ1-40对视网膜色素上皮细胞损伤的影响 20-26 实验材料 20-22 实验方法 22-24 实验结果 24-26 实验二 IL-33 的表达及信号通路研究 26-38 实验材料 26-29 实验方法 29-34 实验结果 34-38 讨论 38-40 结论 40-41 第二部分 IL-33 在视网膜色素上皮细胞中的作用及机制研究 41-71 引言 41 实验一 IL-33 受体的表达研究 41-51 实验材料 41-45 实验方法 45-48 实验结果 48-51 实验二 IL-33 下游炎症因子的表达及信号通路研究 51-65 实验材料 51-54 实验方法 54-59 实验结果 59-65 讨论 65-70 结论 70-71 参考文献 71-77 综述 白介素-33 在疾病中的作用 77-87 参考文献 82-87 攻读学位期间发表文章情况 87-88 致谢 88-89
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中图分类: > 医药、卫生 > 眼科学 > 视网膜及视神经疾病 > 视网膜疾病
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