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ANXA2在视网膜新生血管形成过程中的表达及作用机制

作　者: 王猛
导　师: 董晓光
学　校: 青岛大学
专　业: 眼科学
关键词: 膜联蛋白A2 氧诱导 视网膜新生血管 基因干扰
分类号: R774.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 61次
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内容摘要


目的通过观察ANXA2在体外高糖培养的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)及氧诱导C57BL/6J小鼠视网膜新生血管中的表达,研究ANXA2对HUVEC增殖,迁移,成管能力的影响,对小鼠视网膜新生血管发育的影响,以及对新生血管相关因子表达的调控,探讨ANXA2在视网膜新生血管形成过程中的作用和机制。方法(1)体外实验应用HUVEC细胞,实验分四组：正常组(Normal,常规培养),高糖培养下的高糖对照组(Mock,无处理)、阴性干扰组(SiControl)、阳性干扰组(SiANXA2)。应用Real-time PCR和Western blot方法检测各实验组HUVEC中膜联蛋白A2 (ANXA2)基因及蛋白的表达情况,MTT方法检测各组0h,24h,48h和72h细胞增殖能力,划痕实验观察各实验组细胞迁移能力,成管实验评估细胞的成管能力。并通过Real-time PCR检测各实验组中新生血管相关因子VEGFA,MMP2,MMP9,TIMP2的mRNA表达情况。(2)体内实验应用C57BL/6J小鼠。小鼠出生后7天,放入氧浓度75-80%氧箱内5天后取出正常环境下饲养,构建氧诱导(OIR)小鼠模型。实验分四组：正常组(Normal,正常饲养),OIR空白对照组(Mock,无处理),OIR阴性干扰组(SiANXA2_M)、和OIR阳性干扰组(SiANXA2)。分别取正常组和OIR空白对照组出生后12,13,14,15,16,17,21,30天小鼠,异硫氰酸标记的右旋糖酐(FD-2000S)行上腔静脉灌注,视网膜铺片,荧光显微镜对比观察氧诱导视网膜新生血管形态学变化,应用Real-time PCR检测对比两组间相应日龄小鼠视网膜ANXA2 mRNA的表达变化。选择小鼠出生后17天(P17)时间点,分别提取4组中小鼠视网膜标本,通过视网膜铺片方法对比观察视网膜新生血管形态学变化,Real-time PCR及Western blot检测各组中ANXA2的表达及ANXA2基因干扰后新生血管相关因子Vegfa,Mmp2,Mmp9, Timp2的表达变化。应用SPSS软件对数据行统计学处理,应用单因素方差分析进行组间比较(P<0.05)。结果(1)体外实验：高糖对照组HUVEC中ANXA2表达显著高于正常组(P<0.05)。高糖对照组HUVEC的增殖,细胞迁移数量(102.3±4.9 VS 50.3±2.5)和成管数量(17.3±1.5 VS 10±1.4)以及VEGFA, MMP2,MMP9和TIMP2的mRNA表达均显著高于正常组(P<0.05)。基因干扰后,在基因和蛋白水平均表明ANXA2在阴性干扰组表达无明显改变,在阳性干扰组表达有明显下降,SiANXA2可以成功干扰ANXA2基因的表达。ANXA2基因表达下降后,HUVEC的增殖、细胞迁移数量(41.1±1.5 VS 102.3±4.9)和成管数量(7.6±1.2 VS 17.3±1.5)显著下降,VEGFA,MMP2,MMP9,TIMP2表达明显下调(P<0.05)。(2)体内实验：ANXA2在视网膜血管发育旺盛期高表达,在平缓期低表达。P17小鼠视网膜铺片发现,与OIR空白对照组和OIR阴性干扰组相比,OIR阳性干扰组视网膜新生血管迂曲现象减轻,血管渗漏较少,微血管瘤及新生血管芽减少。视网膜层次较明显。OIR空白对照组ANXA2表达显著高于正常组(P<0.05)。ANXA2基因沉默后,ANXA2在OIR阳性干扰组表达有明显下降(P<0.05)。Vegfa,Mmp2,Mmp9在OIR空白对照组较正常组显著上调,在OIR阳性干扰组较OIR空白对照组显著下调(P<0.05)。结论ANXA2在高糖培养的HUVEC和氧诱导小鼠视网膜新生血管中均高表达,与血管内皮细胞内皮细胞增殖,迁移和成管能力相关,可调节新生血管相关因子的表达,参与视网膜新生血管的形成。RNA干扰技术能成功抑制ANXA2基因的表达,ANXA2有望成为防治视网膜新生血管新的靶点。

全文目录


摘要  2-4
Abstract  4-7
引言  7-9
第一章 ANXA2对体外高糖培养的人脐静脉内皮细胞增殖,迁移,成管能力及新生血管相关因子表达的影响  9-26
  1.1 材料和方法  9-18
    1.1.1 实验耗材  9-10
    1.1.2 实验仪器  10-11
    1.1.3 实验方法  11-18
  1.2 结果  18-23
  1.3 讨论  23-26
第二章 ANXA2对氧诱导C57BL/6J小鼠视网膜新生血管形成及相关因子表达的影响  26-42
  2.1 材料和方法  26-33
    2.1.1 实验动物  26
    2.1.2 实验耗材  26-28
    2.1.3 实验仪器  28
    2.1.4 实验方法  28-33
  2.2 结果  33-39
  2.3 讨论  39-42
结论  42-43
参考文献  43-48
综述  48-60
  综述参考文献  56-60
攻读学位期间的研究成果  60-61
致谢  61-62

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中图分类: > 医药、卫生 > 眼科学 > 视网膜及视神经疾病 > 视网膜疾病
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