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人重组粒细胞集落刺激因子对体外培养大鼠视网膜神经节细胞的保护作用及机制的研究

作　者: 许海涛
导　师: 吴雅臻
学　校: 吉林大学
专　业: 眼科学
关键词: 集落细胞刺激因子视网膜神经节细胞无血清神经基质培养基生长相关蛋白-43 微管相关蛋白-2
分类号: R774.6
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本文通过试验研究了粒细胞集落刺激因子（G-CSF）对视网膜神经节细胞（retinalganglion cells, RGCs）体外存活的影响，以及对损伤后RGCs的保护作用，并探讨其可能的作用机制。实验中我们首先体外培养了RGC-5细胞系，观察其形态及性状，应用MTT法、流式细胞术、Western Blot方法检测rhG-CSF干预后RGC-5活性和增殖的变化及其机制。结果表明G-CSF能够增强体外培养RGC-5的活性、促进RGC-5的增殖、诱导RGC-5中STAT3的磷酸化，并且G-CSF-R参与STAT3的活化过程。提示G-CSF可以通过G-CSFR途径诱导RGC-5中STAT3的活化来达到促进其活性和增殖的目的。为了更加明确的说明G-CSF对视神经的保护作用，本实验选用了特异性的Thy1.1单克隆抗体联合无血清的神经基质培养基（NEUROBASALTMMedium）纯化培养大鼠视网膜神经节细胞，得到细胞纯度可高达95%。随后我们应用无血清的神经基质培养基与含血清的DMEM同时培养RGCs，进行对比观察RGCs形态学变化，应用MTT法、流式细胞术检测两组细胞的存活率及凋亡率，结果显示无血清的神经基质培养基可明显提高RGCs体外存活率及存活时间，降低RGCs体外凋亡率。这提示我们Thy-1.1单克隆抗体与NEUROBASALTMMedium联合应用于RGCs的体外纯化与培养，可明显维持体外RGCs的活性并延长其在体外的存活时间。因此利用以上方法体外培养视网膜神经节细胞，在Cocl2诱导的缺氧情况下加入rhG-CSF，应用rt-PCR及Wetern Blot方法检测RGCs上GAP-43、MAP-2、RhoA、Rock、Bcl-2、Caspase3和Bax蛋白及mRNA表达量的变化，同时应用流式细胞术检测RGCs的凋亡率，结果显示G-CSF可能通过下调RhoA、Rock表达来增加GAP-43、MAP-2蛋白及mRNA的表达量，从而促进细胞突起的生长与修复，通过上调Bcl-2的表达，下调Caspase3和Bax的表达来明显减低RGCs的凋亡率。说明G-CSF通过抗凋亡途径及增加细胞生长发育相关蛋白表达量来保护损伤后的RGCs。本文的创新点如下：1证明了G-CSF可以通过G-CSFR途径诱导RGC-5中STAT3的活化来达到促进RGC-5活性和增殖的目的。2G-CSF可能通过下调RhoA、Rock表达量及增加GAP-43、MAP-2的表达量来促进RGCs突起的再生与修复。

全文目录

中文摘要  5-8
Abstract  8-12
英文缩略词表  12-17
第1章 GCS-F 与缺血性视神经病变发病机制的相关研究  17-32
  1.1 G-CSF 概述  17-22
    1.1.1 G-CSF 的分子结构  17
    1.1.2 G-CSF 受体（G-CSFR）  17-20
    1.1.3 G-CSF 的生物学作用  20-22
  1.2 缺血性视神经病变(ischemic optic neuropathy，ION)概述  22-30
    1.2.1 缺血性视神经病变(ION)的分类  22-23
    1.2.2 非动脉炎性前部缺血性视神经病变(NA-AION)的发病原因及机制  23-27
    1.2.3 前部缺血性视神经病变（AION）的治疗  27-30
  1.3 G-CSF 对缺血性视神经病变的保护作用  30-32
第2章 rhG-CSF 对 RGC-5 活性的影响及增殖机制的研究  32-44
  2.1 实验材料  32-34
    2.1.1 实验对象  32
    2.1.2 主要试剂  32-33
    2.1.3 主要仪器  33-34
  2.2 实验方法  34-37
    2.2.1 体外 RGC-5 培养  34
    2.2.2 MTT 法检测 rhG-CSF 对 RGC-5 活性的影响  34
    2.2.3 流式细胞仪检测 rhG-CSF 对 RGC-5 增殖的影响  34
    2.2.4 rhG-CSF 对 RGC-5 增殖影响机制的研究  34-37
    2.2.5 统计学处理  37
  2.3 结果  37-40
    2.3.1 贴壁 RGC-5 的形态学观察  37-38
    2.3.2 不同浓度 rhG-CSF 对 RGC-5 活性的影响  38
    2.3.3 不同浓度 rhG-CSF 对 RGC-5 周期的影响  38-39
    2.3.4 rhG-CSF 对 RGC-5 增殖影响的机制  39-40
  2.4 讨论  40-43
  2.5 小结  43-44
第3章视网膜神经节细胞体外培养、纯化及鉴定  44-55
  3.1 实验材料  44-46
    3.1.1 实验对象  44
    3.1.2 主要试剂  44-45
    3.1.3 实验仪器；  45-46
  3.2 实验方法  46-48
    3.2.1 RGCs 悬液的制备  46
    3.2.2 RGCs 的纯化培养和鉴定  46-48
    3.2.3 统计学处理方法  48
  3.3 结果  48-51
    3.3.1 纯化后 RGCs 的形态学观察  48-49
    3.3.2 RGCs 免疫细胞化学检测鉴定情况  49-50
    3.3.3 不同培养基培养纯化 RGCs 体外存活的观察结果  50-51
    3.3.4 不同培养基培养的纯化 RGCs 凋亡的观察结果  51
  3.4 讨论  51-54
    3.4.1 RGCs 体外培养的取材  52
    3.4.2 RGCs 的纯化及意义  52
    3.4.3 无血清神经基质培养基（NEUROBASALTMMedium）的应用  52-54
  3.5 小结  54-55
第4章 rhG-CSF 对纯化培养大鼠视网膜神经节细胞突起生成的影响以及在缺氧下的视神经保护作用  55-68
  4.1 实验材料  55-57
    4.1.1 实验动物  55
    4.1.2 主要试剂  55-56
    4.1.3 主要仪器  56-57
  4.2 实验方法  57-59
    4.2.1 rhG-CSF 对 RGCs 突起生长的影响  57
    4.2.2 rhG-CSF 对缺氧后 RGCs Caspase-3、 Bcl-2 和 Bax 的表达的影响  57
    4.2.3 流式细胞仪检测缺氧后不同时间 rhG-CSF 对 RGCs 凋亡的影响  57
    4.2.4 实时 PCR 测定 rhG-CSF 对缺氧后 RGCsGAP-43、MAP-2mRNA 表达的影响  57-58
    4.2.5 Western blot 检测 rhG-CSF 对缺氧后 RGCs 的 GAP-43、MAP-2 蛋白表达的影响  58
    4.2.6 rhG-CSF 对缺氧后 RGCs 中 RhoA/Rock 表达量的影响  58-59
    4.2.7 统计学分析  59
  4.3 实验结果  59-64
    4.3.1 rhG-CSF 促进 RGCs 突起生长  59
    4.3.2 rhG-CSF 降低缺氧后凋亡相关蛋白 Caspase-3 表达量  59-60
    4.3.3 rhG-CSF 上调缺氧后凋亡相关蛋白 Bcl-2 和 Bax 表达的比率  60
    4.3.4 rhG-CSF 抑制 RGCs 凋亡的结果的观察  60-61
    4.3.5 rhG-CSF 上调 GAP-43、MAP-2 mRNA 的表达  61-62
    4.3.6 rhG-CSF 上调 GAP-43、MAP-2 蛋白的表达  62-63
    4.3.7 G-CSF 降低缺氧后 RGCs 中 RhoA/Rock 表达  63-64
  4.4 讨论  64-67
  4.5 小结  67-68
第5章结论  68-69
参考文献  69-94
作者简介及在学期间所取得的科研成果  94-95
致谢  95

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