学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

基于RNA-seq技术的肝细胞肝癌转录组学研究

作　者: 刘寒强
导　师: 陈志南; 邢金良
学　校: 第四军医大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 下一代测序肝癌转录组乙型肝炎病毒外显子
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
下　载: 149次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

在全基因组层面上阐明基因及外显子的表达水平,尤其是鉴定新的剪接异构体,RNA-seq具有独特的优势。迄今为止,利用RNA-seq对HBV相关HCC的转录组分析尚未报道。在本项目中,基于Solexa/Illumina GAII测序平台读长36bp单末段测序方法,我们首次对10个HCC患者配对的癌及癌旁组织的转录组进行了测序分析。研究结果表明:每一个测序通道,平均产生了21.6百万测序读数及10.6百万配齐读数,这些读数覆盖了已注释基因的50%以上,能够满足后续的数据分析。此外,基于HCC转录组数据库,我们进一步通过基因表达水平分析发现了1,378个差异表达基因及24,338差异表达的外显子,功能分析表明它们主要参与了细胞生长、代谢及免疫应答,这些结果初步揭示了HCC发生机制的复杂性。染色体定位分析发现差异表达的基因大部分位于染色体8q21.3-24.3。最有意义的结果是:通过外显子的分析获得了序列的变异信息及新的转录本信息。最后,我们鉴定了ATAD2基因存在有一个新的exon-exon junction,且在HCC癌组织中显著上调,并利用实时定量PCR进行了验证。总之,我们从基因及外显子表达水平,选择性剪接异构体等方面对HBV相关HCC的转录组进行了全面分析,对阐明HCC的分子病理机制方面提供了重要的线索。本项目的主要研究内容:1.RNA-seq测序深度及数据质量的评估。2.RNA-seq数据与基因芯片数据的比较。3.肝癌及癌旁的差异基因分析,并利用实时定量PCR在大样本中进行验证。4.差异基因的染色体定位分析,及染色体扩增、缺失的分析。5.对差异基因的功能注释,包括信号通路及生物学功能。6.肝癌及癌旁的差异表达的外显子分析,并利用实时定量PCR在大样本中进行验证。7.鉴定新的选择性剪接体,并利用实时定量PCR在大样本中进行验证。本项目的主要研究结果:1.首次利用RNA-seq技术对HBV相关的肝细胞肝癌进行了全转录组测序,发现了1378个差异表达的基因及24338个差异表达的外显子。2.在差异表达基因的功能注释分析中,确定了与肝细胞肝癌发生密切相关的54条生物学功能及41条信号通路。3.多个染色体异常位置被发现,最显著的为8q24。4.在外显子水平上,鉴定了多种选择性剪接模式,尤其是最有代表性的三种剪切模式在20对样本中利用实时定量PCR技术得到了验证。5. ATAD2基因的一个新的剪接异构体被发现,并且其在癌中的表达显著高于癌旁组织。结论:总之,我们从基因,外显子及选择性剪切模式三个方面,全面系统的阐明了HBV相关的肝细胞肝癌的转录特点,为进一步深入理解肝细胞肝癌发生发展的分子病理机制奠定了基础。

全文目录

缩略语表  6-8
中文摘要  8-11
Abstract  11-14
Introduction  14-16
文献回顾  16-47
  1 转录组学概述  16-17
  2 转录组学研究的传统方法  17-34
  3 基于新一代测序技术的高通量转录组学研究方法  34-45
  4 肝癌的转录组学研究  45-47
Study contents  47-86
  Part 1：HCC sample preparation and RNA-sequencing  47-65
    1 materials  47-48
      1.1 Patients and tissue specimens  47
      1.2 Regents  47-48
      1.3 Experimental equipment  48
    2 Methods  48-57
    3 Results  57-64
      3.1 The clinical features of the patients  57-58
      3.2 Total RNA concentration and integrity test  58-59
      3.3 RNA-seq analysis of 10 matched pairs of HCC and adjacent non-cancerous tissues  59-60
      3.4 evaluation of data quality and sequencing depth required for transcriptome analysis  60-62
      3.5 Comparison between RNA-seq and microarray  62-64
    4 Discussion  64-65
  Part 2 Global analysis of HCC transcriptome  65-86
    1 Material  65
      1.1 Experimental Equipment  65
      1.2 Reagents  65
    2 Method  65-70
      2.1 RNA extraction  65
      2.2 RT-PCR  65-66
      2.3 Real time RT-PCR  66
        2.3.1 TaqMan RT-PCR  66
        2.3.2 SYBGreen RT-PCR  66
      2.4 Primers or Probes and PCR conditions for real time RT-PCR  66-70
      2.5 Global analysis of RNA-seq data  70
        2.5.1 Alignment of sequenced reads  70
        2.5.2 Evaluation of data quality and sequencing depth  70
        2.5.3 Differential expression analysis of gene, exon and novel exon-exon junction  70
        2.5.4 Comparison between RNA-seq and public microarray data  70
        2.5.5 Functional annotation and positional gene enrichment analysis  70
        2.5.6 Identification of novel differentially expressed exon-exon junctions  70
    3 Results  70-82
      3.1 Differential gene expression and validation  70-73
      3.2.The chromosome locations of DEGs  73-74
      3.3 Functional annotation of DEGs  74-76
      3.4.Exon expression level analysis  76-81
      3.5 Identification of novel DE exon-exon junctions  81-82
    4 Discussion  82-86
conclusion  86-87
Supplementary  87-97
  Supplementary 1  87
  Supplementary 2  87-93
  Supplementary 3  93-94
  Supplementary 4  94
  Supplementary 5  94-95
  Supplementary 6  95-97
References  97-112
个人简历和研究成果  112-113
致谢  113

基于RNA-seq技术的肝细胞肝癌转录组学研究

内容摘要

全文目录

相似论文