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食管癌Eca109单克隆细胞株的干细胞特性研究

作　者: 赵生霞
导　师: 慕晓玲
学　校: 石河子大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 食管癌肿瘤干细胞分离与鉴定
分类号: R735.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：筛选食管癌干细胞及其特异性标志物。方法：采用有限稀释法分离培养食管癌Eca109单克隆细胞株。HE染色观察单克隆细胞株的细胞形态，采用细胞免疫荧光技术及免疫细胞化学法检测干细胞标记物P75^NTR、Oct-4、SOX₂、Lin28、Nanog在各细胞株中的表达定位。应用平板克隆形成实验及MTT法连续监测7天检测并比较各细胞株的体外增殖情况；检测食管癌Eca109单克隆细胞株在不同浓度化疗药作用48小时后存活比例的比较；Transwell小室法检测细胞的侵袭能力。结果：（1）采用有限稀释法成功获得两种形态的单克隆细胞株，分别为小圆形和短梭形，将小圆细胞、短梭细胞及未分选的Eca109细胞接种于盖玻片上行常规HE染色，显微镜下观察：小圆细胞胞质少，核大、圆形，短梭形细胞核相对较小，胞质丰富。（2）干细胞标记物P75^NTR、Oct-4、SOX₂、Lin28、Nanog在各细胞株中均阳性表达，其中SOX₂、Lin28在三种细胞中表达情况相似，即SOX₂荧光均定位于细胞浆，Lin28荧光均定位于细胞核。P75^NTR、Oct-4在圆形细胞上荧光定位于细胞的胞核，在梭形细胞上定位于细胞的胞浆。Nanog在圆形细胞上荧光定位于细胞胞浆，在梭形细胞上定位于细胞的胞核。（3）MTT检测结果示圆细胞株增殖率明显高于其他细胞株，差异显著（P<0.001）。圆形、梭形、未分选细胞接种于培养板中培养15天后形成细胞数大于50个的克隆形成率分别为38%、6%、22%，圆形细胞克隆形成的细胞团明显大于其它两种细胞。（4）化疗药物作用24小时后，可见96孔板中培养的食管癌细胞生长受阻，48小时后出现小部分漂浮死亡的细胞，随着药物浓度的增大，细胞死亡比例相对增多，形态也有所改变，发现在浓度较低的卡铂和紫杉醇作用下，梭形细胞和未分选细胞均有少部分细胞死亡，而圆形细胞出现了少量的增殖；在较高浓度药物作用后，梭形细胞和未分选细胞的存活细胞明显减少，圆形细胞表现出较强的耐药性，只有少量的细胞死亡。在化疗药物丝裂霉素C的作用下，三种细胞均有不同程度的死亡，但每个浓度作用下圆形细胞的存活细胞数均比其他两种细胞多。（5）Transwell小室法结果示各单克隆细胞株之间侵袭能力相差不大。结论：（1）食管癌细胞中可能存在食管癌干细胞；（2）干细胞标志物P75^NTR、Oct-4和Nanong在细胞中的表达部位不同，推测这两种抗体可能是分选食管癌干细胞的重要标记物。（3）单个细胞克隆分选出的圆形食管癌Eca109细胞具有肿瘤干细胞的特性，其可能是食管癌干细胞。

食管癌Eca109单克隆细胞株的干细胞特性研究

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