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纳米/微米SiO_2颗粒致人肺腺癌细胞A549毒作用研究

作　者: 赵婉云
导　师: 杨惠芳
学　校: 宁夏医科大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 纳米/微米SiO2 A549细胞 细胞毒性 炎性反应 氧化损伤
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


背景与目的纳米SiO2由于其优越的稳定性及其独特的性质，在医药，化妆品，石油化工等领域应用广泛，职业生产及产品使用人群增多。微米级SiO2是自然界及工业生产已知的典型肺毒物，其对肺脏的毒性作用已得到了科学论证，但是随着工业化发展及纳米SiO2的广泛应用，人群接触颗粒物复合暴露的几率越来越大，微米级与纳米级SiO2复合暴露对机体产生的影响，作用途径还有待进行深入的研究。已有国内外研究表明，纳米SiO2可从多个水平对机体造成毒性损伤，并且由于其特殊的理化性质使得主要作用的靶器官为肺脏和脾脏。所以本研究拟通过体外细胞培养的方式，探讨纳米/微米SiO2颗粒单独及复合暴露对A549细胞的细胞毒性作用、炎性反应及氧化损伤指标的影响，进一步补充和完善纳米SiO2对肺细胞死亡途径的方式及作用机制，为纳米SiO2接触人群的健康监护及疾病防治提供一定的科学依据。方法采用体外细胞培养的方式，分别建立人肺腺癌细胞A549与纳米/微米SiO2单独、复合暴露模型。采用透射电镜（TEM）从形态学上观察两种粒径纳米颗粒在无血清细胞培养液中的团聚情况以及其进入细胞的形式；以染毒浓度为3.13μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL进行MTT及CCK-8实验，以定量测定纳米/微米对A549细胞增殖活性的影响并确定后续试验的低、中、高剂量组；以染毒浓度为6.25μg/mL、25.0μg/mL及100μg/mL分别为实验的低、中、高剂量组，一次性染毒24h后，通过对氧化损伤指标ROS与LDH的检测来鉴定细胞内氧化应激水平的变化，其中用DCFH-DA法定性测定颗粒对细胞内ROS的影响，微量酶标法定量测定细胞上清液中LDH水平；通过ELISA法检测细胞上清液中炎性反应因子IL-6、IL-8及TNF-α水平的变化。利用SPSS18.0统计软件进行分析，资料采用均数±标准差（x±s）表示，各组与对照组比较采用AVONA分析，两两比较用q检验，p<0.05时认为有统计学差异，α=0.05。结果1.纳米SiO2在溶液中分散情况及进入细胞情况分析：两种粒径纳米SiO2在培养液中均呈团聚状态，并且也是以团聚状态穿过细胞膜及核膜，同时对细胞造成损伤，致细胞死亡方式包括细胞坏死和细胞凋亡两种。2.纳米/微米SiO2对细胞毒性作用分析：纳米/微米单独或复合暴露均可对A549细胞造成损伤作用（p<0.05），且各染毒组均呈现剂量-反应关系（p<0.05）。统计分析显示单独暴露组之间纳米组细胞毒性作用大于同剂量微米组（p<0.05）；30纳米组略高于50nm组（p<0.05）；复合暴露组对细胞抑制作用高于同剂量单独暴露组（p<0.05）的趋势。3.纳米/微米SiO2致细胞氧化损伤分析：各低、中、高剂量下，纳米/微米单独或复合暴露均可对A549细胞造成氧化损伤作用（p<0.05）。在对细胞内ROS定性检测与LDH定量检测中，可见各组ROS荧光强度有剂量-效应关系；细胞上清液中LDH水平呈现剂量-反应关系。两指标总体均呈现单独暴露组之间纳米组细胞氧化损伤作用大于同剂量微米组（p<0.05）；两种粒径纳米SiO2颗粒相比，同浓度30nm组对细胞氧化损伤作用较50nm组高（p<0.05）；复合暴露组对细胞氧化损伤作用高于同剂量单独暴露组（p<0.05）的趋势。4.纳米/微米SiO2致细胞炎性反应分析：各低、中、高剂量下，纳米/微米单独或复合暴露均可引起A549细胞上清液中炎性反应因子IL-6、IL-8及TNF-α水平升高，且存在剂量-反应关系（p<0.05）。三个指标总体均呈现单独暴露组之间纳米组细胞上清液中炎性反应水平高于同剂量微米组（p<0.05）；两种粒径纳米SiO2颗粒相比，同浓度30nm组对细胞炎性损伤作用较50nm组高（p<0.05）；复合暴露组细胞炎性反应水平高于同剂量单独暴露组（p<0.05）的趋势。结论1.纳米/微米SiO2颗粒单独或复合暴露均可通过细胞坏死及细胞凋亡两种方式引起人肺腺癌细胞A549损伤，抑制细胞增殖，损伤主要呈现在对细胞器及细胞核的损害。各组整体呈现剂量-效应关系，单独暴露组细胞毒效应较复合暴露组低，且呈现粒径相关性。2.纳米/微米SiO2颗粒单独或复合暴露均可引起人肺腺癌细胞A549内氧化应激因子及炎性反应因子的释放，产生氧化损伤作用与炎性损伤。各组整体呈现剂量-效应关系，单独暴露组氧化损伤效应较复合暴露组低，且呈现粒径相关性。3.纳米SiO2颗粒引起人肺腺癌细胞A549细胞损伤，一方面可能是细胞内氧化应激反应和炎性因子的释放引起细胞坏死及细胞凋亡线粒体途径的发生发展。另一方面与颗粒物以团聚状态对细胞生物膜及细胞器造成物理损伤有关。4.纳米SiO2颗粒致细胞坏死与凋亡机制及途径还有待进一步深入的研究。

全文目录


摘要  4-7
ABSTRACT  7-13
前言  13-16
研究对象与方法  16-29
结果  29-44
讨论  44-48
结论  48-49
参考文献  49-53
综述  53-61
  综述参考文献  58-61
致谢及基金资助  61-62
攻读学位期间发表的学术论文  62-63
个人简历  63

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
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