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同源盒基因HOXB7在肺腺癌增殖与转移中的作用研究

作　者: 原薇薇
导　师: 胡义德
学　校: 第三军医大学
专　业: 肿瘤学
关键词: HOXB7 RNA干扰肺腺癌增殖转移临床预后调控靶标细胞周期移植瘤
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景和目的目前，肺癌发病率和病死率位于各类癌症之首。肺癌分为小细胞肺癌与非小细胞肺癌两大类，其中非小细胞肺癌中最常见的是肺腺癌、肺鳞癌和肺大细胞癌三个亚型。肺腺癌(Lung adencarcinoma，LAC)的发病在所有类型肺癌中占第一位，已经达到40％。大量临床资料显示，肺腺癌的高侵袭力和易转移性是导致临床治疗失败和预后不良的主要原因，约90%的肺腺癌病人死于癌细胞的多器官转移。迄今为止，肺腺癌发病的危险因素已被初步确定，但有关其快速侵袭与转移的详细机制尚不清楚。因此，发现特异性的肺腺癌治疗靶标，深入探明调控肺腺癌增殖与转移的相关机制并进行针对性干预，对提高肺癌病人的疗效十分重要。研究证实，与细胞分化、发育相关的同源盒分子如Oct4、Nanog等参与肺癌侵袭转移的调节。而同属于同源盒基因的HOX(Homeobox genes)基因家族类似作用越来越受到关注。HOX基因家族共包括39个含高度保守同源结构域的基因，分为HOXA、HOXB、HOXC和HOXD四簇，分别位于第7、17、12、2号染色体。HOX基因家族主要负责调节脊椎类动物和人类胚胎器官发育。作为细胞增殖和分化的主控基因，其表达蛋白的作用靶标通常为膜蛋白受体、粘附分子、生长因子等与肿瘤进展、转移密切相关的基因家族。研究表明，一些在成体细胞时期本该关闭的HOX基因迷乱表达，参与肿瘤的发生发展，尤其是肿瘤发展的后期阶段。在肺癌、乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤中可检测到HOX基因的异常表达。另外，研究发现在干细胞中，HOX基因家族也参与其自我更新、无限增殖等干细胞特性的调控。其中，HOXB7是近年来研究的热点。HOXB7属于HOX基因家族B簇，位于第17号染色体，已被确证属于癌基因的范畴。胚胎发育时期，HOXB7是主要负责调控上皮包括肺上皮细胞增殖、分化、迁移的主控基因。目前，已有研究表明在结肠癌及口腔癌中，HOXB7表达异常增高，并与恶性肿瘤快速进展及预后不良相关。在乳腺癌中，异常高表达的HOXB7导致肿瘤细胞EMT (Epithelial-mesenchymal transition，EMT)并诱导肿瘤干细胞生成，进而影响肿瘤转移。但有关HOXB7基因在肺腺癌中的表达情况以及其是否参与调控肺腺癌肿瘤细胞恶性进展与转移的能力，目前尚未见文献报道。本课题通过检测肺腺癌细胞系及病人肿瘤组织中HOXB7基因的表达情况，结合临床病理学变量，初步探讨HOXB7表达在肺腺癌中意义，并进一步利用RNA干扰使HOXB7基因沉默。我们发现HOXB7降低表达可导致肺腺癌细胞体外增殖减慢、细胞周期阻滞、细胞迁移及侵袭能力降低。皮下注射HOXB7降低表达的肺腺癌细胞的裸鼠比对照组更晚产生肿瘤，且肿瘤体积更小。腹腔注射HOXB7降低表达的肺腺癌细胞的裸鼠比对照组发生更少的器官转移。综上所述，本研究从细胞和实验动物水平证明HOXB7是肺腺癌细胞增殖和转移能力的重要调控因子，可成为控制肺腺癌的恶性进展与转移的临床防治新的靶点。研究方法1.同源盒基因HOXB7在肺腺癌细胞系及病人组织中的表达与意义①从ATCC购买正常肺支气管腺上皮细胞系HBE以及肺腺癌细胞系A549、H1975、H1650、H322等，利用RT-PCR、Western blot等方法检测在各肺腺癌细胞系中HOXB7的mRNA及蛋白表达情况。②收集75例临床肺腺癌病人手术切除肿瘤组织标本及其癌旁正常组织标本，石蜡包埋，制作组织芯片。采用免疫组织化学染色方法，分析HOXB7蛋白表达与肺腺癌的临床分期、病理分级、远处转移能力、生存期等临床病理学变量的相关性。2.同源盒基因HOXB7调控肺腺癌细胞体外增殖及体内成瘤能力在A549细胞系中，采用逆转录病毒介导的标记有绿色荧光蛋白(GFP)的质粒载体进行HOXB7基因的RNA干扰，使HOXB7去表达，并进行以下研究：①利用平板克隆形成实验，检测转染了空白质粒的对照组与HOXB7RNAi干扰组的肿瘤细胞体外增殖能力的差异。②利用流式细胞仪检测对照组与干扰组肿瘤细胞的细胞周期分布差异情况。③将对照组及干扰组肿瘤细胞分别皮下接种于NOD/SCID联合免疫缺陷鼠(6周龄)，每组5只，建立肺腺癌皮下移植瘤模型，每天记录肿瘤生长情况。30天后处死动物。利用公式[长*宽2]/2，计算移植瘤体积。将移植瘤取出，石蜡切片并进行免疫组化染色，观察各组间移植瘤组织的HOXB7及增殖标志如Ki-67蛋白的表达差异情况。3.同源盒基因HOXB7调控肺腺癌细胞转移能力①利用Western blot方法检测对照组与干扰组肿瘤细胞上皮细胞表面标志如E-钙粘蛋白及间质细胞表面标志如波形蛋白和纤连蛋白等蛋白表达差异情况。②利用免疫荧光染色方法检测对照组与干扰组肿瘤细胞上皮细胞表面标志如E-钙粘蛋白及间质细胞表面标志如波形蛋白和纤连蛋白等蛋白表达差异情况。③利用细胞划痕实验及transwell细胞迁移实验检测对照组与干扰组肿瘤细胞体外迁移能力的差异情况。④将对照组及干扰组肿瘤细胞分别腹腔注射于NOD/SCID联合免疫缺陷鼠(6周龄)，每组10只。35天后处死动物，观察腹腔脏器肿瘤转移发生的差异情况。研究结果1.人肺腺癌细胞系A549、H1975、H1650、H322中HOXB7的mRNA及蛋白表达水平明显高于人正常肺支气管上皮细胞系。其中A549细胞系的HOXB7表达水平高于其余几种肺腺癌肿瘤细胞系。2.免疫组织化学染色结果显示，在75例配对组织样本中，有54例(72%)肺腺癌肿瘤组织呈现HOXB7阳性高表达，而仅有7例(9.3%)癌旁正常组织HOXB7表达阳性。进一步相关性检验显示： HOXB7蛋白表达水平与肿瘤T分期(P=0.028),肿瘤临床分级(P=0.029)及淋巴结转移(P=0.012)均呈显著的正相关性，而与肿瘤病理分级(P=0.146)无显著的相关性。另外，Kaplan–Meier生存分析显示肿瘤组织HOXB7蛋白表达水平与临床病人生存时间呈负相关，影响病人的预后。3.用RNAi技术特异性沉默A549细胞HOXB7基因表达，与对照组细胞相比，干扰组细胞中的HOXB7蛋白表达明显受到抑制。平板克隆形成实验结果显示，干扰组细胞形成的集落克隆数明显少于(P<0.001)且小于对照组细胞。流式细胞仪分析细胞周期结果显示，干扰组细胞G1期细胞比例明显高于对照组细胞(P=0.006)，而S期细胞比例明显低于对照组细胞(P=0.002)，说明HOXB7通过影响G1/S细胞周期调控点，调控肺腺癌肿瘤细胞增殖能力。小鼠皮下移植瘤实验结果显示，干扰组小鼠皮下移植瘤体积小于对照组(P=0.007)，说明干扰组细胞体内成瘤能力明显降低。免疫组织化学染色观察移植瘤组织，发现干扰组组织的细胞增殖标志Ki-67表达低于对照组组织。4.利用显微镜观察发现，在形态上，与对照组典型的纺锤形间质细胞形态相比，干扰组细胞向卵圆形的上皮细胞形态转变，并且聚集形成细胞簇。利用Western blot及免疫荧光染色方法检测发现，干扰组肿瘤细胞上皮细胞表面标志E-钙粘蛋白表达明显高于对照组，而间质细胞表面标志波形蛋白和纤连蛋白表达明显低于对照组。细胞划痕实验结果显示，单层细胞被划痕后24h及48h，干扰组细胞划痕修复能力明显低于对照组，说明干扰组细胞横向迁移能力明显降低。Transwell细胞迁移实验检测结果显示，细胞接种Transwell小室24h后，干扰组迁移至小室下层细胞数明显少于对照组(P=0.001)，说明干扰组细胞体外迁移能力明显降低。小鼠体内转移瘤模型结果发现，腹腔注射干扰组细胞的小鼠，腹腔积液少于对照组小鼠且器官转移发生率明显少于对照组小鼠。结论1.HOXB7在肺腺癌细胞系及病人肿瘤组织中异常高表达，且与肿瘤分期、分级及淋巴结转移等病理参数相关，说明其表达与肺腺癌进展及病人预后相关。提示HOXB7可能是肺腺癌的独立预后因子及疾病进展的标志。2.HOXB7参与调控肺腺癌肿瘤细胞体外增殖和体内成瘤能力，控制肿瘤恶性进展。3.HOXB7参与调控肺腺癌肿瘤细胞体外迁移能力，影响体内肿瘤转移。4.进一步深入研究HOXB7对肺腺癌的作用机制，可为控制肺腺癌的恶性进展与转移的临床防治提供新的靶点。

同源盒基因HOXB7在肺腺癌增殖与转移中的作用研究

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