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研究背景和研究目的恶性肿瘤一直是严重危害人类健康和生命的重大疾患,而肺癌是世界范围致死率最高的恶性肿瘤之一,因此揭示癌症的发病机理,寻找遏制和治愈癌症的方法是人们长期面临的挑战。在肺癌的治疗中,药物化疗占据了非常重要的地位,而现有的化疗药物中均存在很大的毒副作用,因此,开发疗效显著、毒副作用小的新型化疗药物非常重要和迫切。随着肿瘤生物学的发展,人们对肿瘤生物特性的认识不断深化。肿瘤细胞以无限增殖为主要特征,细胞增殖、细胞分化、凋亡、自噬等过程均存在不同程度的调控异常,其中细胞周期调控异常是肿瘤发生发展中最基础的机制。因此,针对调控这些过程的关键分子开发新型的化合物自然引起了人们的注意和广泛研究。细胞自噬是广泛存在的一个进化保守的生物学过程,其在细胞应对营养缺乏、细胞器或蛋白损伤及细胞分化、生长调控中均发挥了重要的作用。在肿瘤细胞中,自噬同样发挥了重要作用,一方面其促进了肿瘤细胞在营养匮乏和抗癌治疗的环境中存活下来,另一方面,过度自噬引起的自噬性死亡填补了肿瘤细胞凋亡能力下降的缺陷。因此诱导肿瘤细胞自噬性死亡丰富了肿瘤的治疗策略,引起了人们的关注。一门新兴的交叉学科——化学遗传学在这一领域的研究中发挥了日新月异的作用。化学遗传学是一门应用小分子化合物,对细胞内的生物学过程进行干扰与调控,以此来研究细胞内生物学过程,从而得到参与这些生物过程的关键分子及其作用机制的学科,同时其促进了新型药物的筛选并深化了人们对小分子化合物在生物学上的构效关系的认识。化学遗传学已经形成一套比较成熟的技术平台,在肿瘤机理的研究和新型抗癌药物的开发中发挥了越来越重要的作用。本研究利用化学遗传学技术平台,合成一系列小分子化合物,筛选出两批能够有效抑制人肺腺癌A549细胞生长的小分子化合物,并进一步初步研究了其作用机制。这些研究结果为寻找新型抗肺癌药物提供一定的基础,也为深入认识小分子化合物在生物学上的构效关系积累了数据。研究方法：1.人肺腺癌A549细胞的传代培养2.倒置相差显微镜观察细胞形态学变化3.SRB法检测细胞存活率4. Hoechst33258染色检测细胞凋亡率5.吖啶橙(AO)染色检测细胞酸性膜泡的积累6. western blot检测LC3-Ⅱ表达水平7.乳酸脱氢酶(LDH)活性检测细胞是否发生坏死8.细胞流式技术检测周期研究结果：1.二茂铁基吡唑β氨基醇衍生物对人肺腺癌A549细胞生长抑制作用研究1.1SRB方法检测结果表明,40μM的16种化合物处理A549细胞48小时后与阴性对照组(100%)相比,细胞存活率均显著下降。其中(R)-4a,(S)-4a,(R)-4b、(R)-4d,(S)-4d效应明显,以浓度依赖的方式降低A549细胞的存活率,其IC50值均在30μM左右。1.2观察细胞形态发现,分别用5μM,10μM,20pM,40μM的上述5种化合物处理A549细胞,与对照组相比,细胞数量以浓度和时间依赖的方式减少,但是细胞形态均无明显变化,细胞形态保持完整,未见空泡化、凋亡小体等。1.3乳酸脱氢酶(LDH)活性检测表明,40μM的上述5种化合物分别处理A549细胞48h后,与对照组相比,LDH活性未发生明显变化,这表明上述5种化合物不引起A549细胞的坏死。1.4Hoechst33258活染法检测表明,5μM,10μM,20μM,40μM上述五种化合物分别处理A549细胞48小时后,与对照组相比,未见明显的核固缩、核破裂、核片段化等现象,表明上述五种化合物可能不是通过诱导凋亡来抑制A549细胞的生长1.5吖啶橙染色法检测表明,5μM,10μM,20μM,40μM的上述五种化合物分别处理A549细胞48小时后,与对照组相比,均未出现明显酸性膜泡积累,初步表明化合物没有引起A549细胞自噬性死亡1.6细胞流式技术检测表明,40μM的上述五种化合物分别处理A549细胞48小时后,均显著引起A549细胞G1期周期阻滞。2.吡唑醇衍生物对人肺腺癌A549细胞的生长抑制作用的研究2.1SRB方法检测结果表明,三种吡唑醇衍生物4d,4e,4f分别在60μM浓度下处理A549细胞48小时后,与阴性对照组相比,发现4d,4e导致细胞存活率均显著下降至50%以下,而4f无显著效果。2.2观察细胞形态发现,上述三种化合物在60pM浓度下处理A549细胞,与对照组相比,细胞数量明显减少,但是细胞形态均未见明显变化,细胞保持完整,未见空泡化、凋亡小体等。2.3乳酸脱氢酶(LDH)活性检测表明,60μM的上述3种化合物分别处理A549细胞48h后,与对照组相比,LDH活性未发生明显变化,这表明上述3种化合物不引起A549细胞的坏死。2.4Hoechst33258活染法检测表明,60μM上述3种化合物分别处理A549细胞48小时后,与对照组相比,细胞核均呈暗蓝色,未出现核凝集、核破碎或核边缘化等凋亡特征,表明上述3种化合物可能不是通过诱导凋亡来抑制A549细胞的生长。2.5吖啶橙染色法检测表明,60μM的上述3种化合物分别处理A549细胞48小时后,与对照组相比,4d,4e处理组酸性膜泡数量明显增加,在细胞质中呈弥散状分布,而4f处理组酸性膜泡数量未见明显增加,分布局限于核周围,此结果初步表明化合物4d,4e导致A549细胞自噬,而4f不诱导自噬。2.6western blot法结果表明,上述三种化合物在60μM浓度下分别处理细胞48小时后,4e处理组中A549细胞LC3-Ⅱ表达量明显上调,4d,4f组A549细胞LC3-Ⅱ表达量变化不明显,这进一步支持了化合物4d可以诱导A549细胞自噬的结论。2.7细胞流式技术检测表明,60pM的上述3种化合物分别处理A549细胞48小时后,与对照组相比,4d,4e两种化合物均显著引起A549细胞G1期周期阻滞,而4f处理组细胞周期分布无明显异常。结论：1.16种二茂铁基吡唑β氨基醇衍生物均能显著抑制A549细胞生长,其中(R)-4a,(S)-4a,(R)-4b,(R)-4d,(S)-4d抑制作用呈现浓度依赖性,此抑制作用是通过将细胞阻滞在G1期来实现的。2.4d,4e两种吡唑醇衍生物均能显著抑制A549细胞生长,其抑制作用呈现浓度依赖性,其生物学机制为引起细胞G1期周期阻滞和细胞自噬性死亡。
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