学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

EZH2在肺癌中表达的病理学意义分析

作　者: 万里燕
导　师: 申洪
学　校: 南方医科大学
专　业: 病理学
关键词: EZH2 肺癌 GLC-82细胞定量分析
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 129次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

研究背景与目的：近年来,肺癌的发病率和死亡率一直呈上升趋势,已成为全球面临的严峻的健康问题。预计到2025年,中国的肺癌患者将达到100万,居世界首位。进一步探索与肺癌发生、发展、治疗和预后相关的分子标志物具有积极意义。EZH2(Enhancer of zeste homolog2)是果蝇zeste基因增强子的人类同源物,属PcG (Polycomb Group)基因家族的重要成员之一。它是于1996年被发现的一种新的人类基因,定位于人染色体7q35位置上。PcG和TrxG(Trithorax Group)蛋白是防止细胞身份发生改变的细胞记忆系统的重要成分。PcG蛋白构成不同的PRC (Polycomb Repressive Complex)蛋白质复合物,主要包括PRCl(?)口PRC2。EZH2是组成PRC2蛋白复合物的一个催化亚基,在其功能中起核心作用。EZH2含有一个高度保守SET(Su(var)3-9,E(z)and trithorax)结构域,具有组蛋白甲基转移酶(HMTs)活性。PCR2复合物通过EZH2基因的SET结构域对核小体组蛋白H3的27位赖氨酸(H3K27)进行甲基化修饰,然后触发PCR1复合物成分在特定基因位点聚集从而导致下游靶基因沉默,而这些靶基因涉及了多种生物学基本过程的调控,如细胞凋亡、细胞周期调节、细胞老化和细胞分化等。此外,EZH2与组蛋白脱乙酰化酶(HDACs)、DNA甲基转移酶(DNMTs)在结构和功能上存在联系,三者共同调节转录抑制。近年的研究发现,EZH2在多种肿瘤中明显高表达,如乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、膀胱癌、胃癌等。目前,有关EZH2蛋白在肺癌中的表达尚处于定性层面,且在多种类型肺癌中的研究鲜见报道。基于上述研究现状和背景,本研究采用免疫组化结合图像分析技术,从量化角度探讨EZH2蛋白在肺癌组织中的表达规律及与增殖、预后的关系,并从蛋白和mRNA水平探讨EZH2在不同人肺癌细胞株中的表达情况,用免疫组化方法检测肺癌性胸水脱落细胞EZH2的表达,并利用RNA干扰技术对人肺腺癌细胞株GLC-82进行EZH2基因沉默,探讨EZH2对GLC-82细胞形态、增殖及转移的影响。方法：一、EZH2在肺癌组织中表达的定量分析及与增殖、预后的关系免疫组织化学方法检测32例正常成人肺组织、24例肺良性病变组织、113例肺癌组织、57例对应淋巴结转移癌组织中EZH2蛋白的表达；同时在113例肺癌组织中检测增殖相关抗原Ki67的表达；用计算机ImageproPlus6.0(IPP)图像分析软件定量测试蛋白表达的阳性单位(PU值)二、EZH2在不同人肺癌细胞株及肺癌胸水脱落细胞中的表达免疫组织化学方法检测人不同肺癌细胞株(A549、GLC-82和H358)中EZH2、Ki67和p53蛋白的表达,IPP图像分析软件测试各蛋白表达的PU值；Western Blot方法检测A549、GLC-82和H358细胞中EZH2蛋白的表达,ImageJ图像分析软件测试蛋白表达的灰度值,以目的／内参蛋白灰度比值表示蛋白表达情况；qRT-PCR方法检测A549、GLC-82和H358细胞中EZH2mRNA的表达；免疫组织化学方法检测5例肺癌性胸水和2例结核性胸水脱落细胞中EZH2蛋白的表达情况。三、RNA干扰沉默EZH2基因对人肺腺癌细胞株GLC-82的影响设计合成两条EZH2干扰序列,利用RNA干扰技术将其瞬时转染入人肺腺癌细胞株GLC-82以抑制EZH2基因的表达,通过qRT-PCR、Western Blot方法检测抑制效率,筛选干扰效果较好的EZH2干扰序列来进行后续实验。用IPP图像分析软件测量形态参数以检测细胞的形态变化,MTT实验检测细胞增殖改变,划痕及Transwell实验检测细胞迁移运动能力变化,qRT-PCR检测转移相关基因(VEGF、MMP2、MMP9和TIMP2)在mRNA水平表达的变化；Western Blot检测增殖和转移相关基因(E-cadhern、CyclinD1、Timal、Akt和p-Akt)在蛋白水平的表达变化；细胞滴片免疫组化检测增殖、凋亡和转移相关基因(Ki-67、p53、EGFR和PTEN)在蛋白质水平表达的变化；细胞石蜡切片免疫组化检测增殖、凋亡和转移相关基因(Ki-67、p53、Vimentin和MMP2)在蛋白质水平表达的变化。结果：一、EZH2在肺癌组织中表达的定量分析及与增殖、预后的关系1.EZH2在正常成人肺组织、肺良性病变和肺癌组织中的免疫组化定量结果显示：a)肺癌组织中EZH2的PU值显著大于正常成人肺组织和肺良性病变组织(P=0.000,P=0.000)；正常成人肺组织中EZH2的PU值与肺良性病变组织相似(P=0.716)；EZH2的PU值在支气管扩张、肺大泡及肺结核三种肺良性病变组织间无显著差异(P=0.231)b)小细胞癌中EZH2的PU值分别大于鳞癌和腺癌(P=0.003,P=0.018)；c)肺癌原发灶中EZH2的PU值明显小于其对应的淋巴结转移灶(P=0.001)；伴有淋巴结转移的肺癌中EZH2的PU值大于尚无淋巴结转移的肺癌(P=0.031)；d)高分化肺癌中EZH2的PU值分别小于中-低分化和未分化肺癌(P=0.015,P=0.003)：pTNM分期Ⅰ-Ⅱ期肺癌中EZH2的PU值显著小于Ⅲ-Ⅳ期肺癌(P=0.000)；肺癌组织中EZH2的PU值与患者性别、年龄、吸烟史、大体类型及肿瘤直径均无关(P>0.05)。2.Ki67在肺癌组织中的免疫组化定量结果显示：肺癌组织中Ki67的PU值与患者性别、年龄、吸烟史、组织学类型、大体类型、淋巴结转移情况、分化程度、pTNM分期和肿瘤直径均无关(P>0.05)。3.EZH2和Ki67的表达的相关性和一致性分析结果显示：a)定量EZH2和Ki67蛋白的表达,二者的PU值呈正相关关系(P=0.006,r=0.257)。b)半定量EZH2和Ki67的表达,二者表达无显著差异(P=0.473),吻合度具统计学意义(P=0.000,Kappa=0.411)4.生存分析结果显示：a) EZH2、Ki67的单独表达和二者的联合表达对患者生存时间的影响均无统计学意义(P>0.05)；相比无淋巴结转移、pTNM Ⅰ-Ⅱ期、肿瘤直径<3cm的患者,有淋巴结转移、pTNMⅢ-Ⅳ期、肿瘤直径≥3cm患者生存时间明显缩短(P=0.004,P=0.008,P=0.029)；b) Cox逐步回归分析显示淋巴结转移和肿瘤直径为影响生存时间的独立预后因素(P=0.003,P=0.026)。二、EZH2在不同人肺癌细胞株及肺癌胸水脱落细胞中的表达1.免疫组化检测不同肺癌细胞蜡块EZH2蛋白表达的定量结果显示：a)A549细胞中EZH2的PU值高于GLC-82和H358细胞(P=0.015,P=0.000),GLC-82细胞中EZH2的PU值高于H358细胞(P=0.000)。b)GLC-82细胞中Ki67的PU值高于A549和H358细胞(P=0.000,P=0.000),A549细胞中EZH2的PU值高于H358细胞(P=0.000)。c)A549细胞中p53的PU值高于GLC-82和H358细胞(P=0.000,P=0.000),GLC-82细胞中p53的PU值高于H358细胞(P=0.000)2. Western Blot检测不同肺癌细胞株中EZH2蛋白表达的结果显示：A549细胞中EZH2/β-actin灰度比值分别高于GLC-82和H358细胞(P=0.001,P=0.000),GLC-82细胞中EZH2/β-actin灰度比值高于H358细胞(P=0.002)。3.qRT-PCR检测不同肺癌细胞株中EZH2mRNA表达的结果显示：GLC-82细胞中EZH2mRNA的表达高于A549和H358细胞(P=0.000,P=0.000),A549细胞中EZH2mRNA的表达高于H358细胞(P=0.000)4.免疫组化检测胸腔积液脱落细胞中EZH2蛋白表达结果显示：5例肺癌性胸腔积液中均检测到了EZH2阳性表达的肺癌脱落细胞,2例结核性胸腔积液中均未检测到EZH2阳性脱落细胞。三、RNA干扰沉默EZH2基因对人肺腺癌细胞株GLC-82的影响1. qRT-PCR检测EZH2的抑制效率结果显示：与阴性对照组比较,抑制组1(干扰序列：EZH2-homo-2126)和抑制组2(干扰序列：EZH2-homo-903)中EZH2mRNA的表达分别下调了约89%和75%,抑制组1对EZH2基因的抑制较好。2. Western Blot检测EZH2的抑制效率结果显示：与阴性对照组比较,抑制组1和抑制组2中EZH2蛋白的表达分别下调了约96.6%和57.8%,同样证明抑制组1对EZH2基因的抑制效率较高,故后续实验选用了EZH2-homo-2126这条干扰序列来进行EZH2基因的沉默。3.GLC-82细胞的形态参数测试结果显示：除形态学参数细胞AR在EZH2抑制组中大于阴性对照组(P=0.013),其余各形态学参数均无显著差异(P>0.05)。4.GLC-82细胞的MTT实验结果显示：与阴性对照组相比,EZH2抑制组的GLC-82细胞在24h、48h、72h和96h的OD值均明显降低(P〈0.001),细胞的增殖能力减弱,转染后各时间点细胞的生长抑制率分别为41.2%、55.8%、44.4%和41.8%,以转染后48h最高。5.GLC-82细胞的划痕实验结果显示：与阴性对照组相比,EZH2抑制组在划痕后的第Oh、12h、24h、36h、48h的细胞迁移速度均显著减慢。6.GLC-82细胞的transwell(?)、室实验结果显示：与阴性对照组相比,EZH2抑制组穿过膜的细胞数目显著减少(P=0.002)。7.qRT-PCR检测(VEGF、MMP2、MMP9和TIMP2) mRNA水平变化结果显示：抑制EZH2的表达后,GLC-82细胞中VEGF和MMP9的mRNA水平表达显著下降(P=0.000,P=0.004),MMP2和TIMP2的mRNA水平表达无显著改变(P=0.090,p=0.116)。8. Western Blot检测(E-cadherin、CyclinD1、Tiam1、Akt和p-Akt)蛋白水平变化结果显示：抑制EZH2的表达后,GLC-82细胞中E-cadherin/β-actin和Tiaml/β-actin的灰度比值显著升高(P=0.000,P=0.001),p-Akt/β-actin的灰度比值.显著下降(P=0.001),CyclinD1/β-actin和Akt/β-actin的灰度比值无明显变化(P=0.592,P=0.156)。9.细胞滴片免疫组化检测(Ki-67、p53、EGFR和PTEN)蛋白水平变化结果显示：抑制EZH2的表达后,GLC-82细胞中Ki67、p53和EGFR的PU值显著降低(P=0.000,P=0.002,P=0.000),PTEN的PU值无明显变化(P=0.822)。10.细胞蜡块免疫组化检测(Ki-67、p53、Vimentin和MMP2)蛋白水平变化结果显示：抑制EZH2的表达后,GLC-82细胞中Ki67、p53和Vimentin的PU值显著降低(P=0.000,P=0.000,P=0.000),MMP2的PU值无明显变化P=0.178)。结论：1.EZH2可能与肺癌的发生、发展及转移有关。2.肺癌中EZH2高表达促进肿瘤细胞的增殖。3.EZH2表达水平对肺癌患者生存时间的影响无明显统计学意义。4.5例肺癌胸水中均检测到EZH2蛋白阳性表达的肺癌脱落细胞,可为肺癌的细胞学诊断初步提供新的思路。5.EZH2基因对人肺腺癌细胞GLC-82形态结构无明显影响,使细胞的增殖、迁移运动能力增强,使增殖、转移和凋亡相关基因VEGF和MMP9的mRNA水平表达下降,E-cadherin和Tiam1的蛋白水平表达升高,p-Akt、Ki67、p53、EGFR和Vimentin的蛋白水平表达下降。

全文目录

摘要  3-9
ABSTRACT  9-19
前言  19-29
  全文技术路  24-25
  参考文献  25-29
第一章 EZH2在肺癌中表达的定量分析及与增殖、预后的关系  29-52
  一材料与方法  29-33
  二结果  33-46
  三讨论  46-48
  参考文献  48-52
第二章 EZH2在不同人肺癌细胞株及肺癌胸水脱落细胞中的表达  52-77
  一材料与方法  52-62
  二结果  62-71
  三讨论  71-74
  参考文献  74-77
第三章 RNA干扰沉默EZH2基因对人肺腺癌细胞株GLC-82的影响  77-106
  一材料与方法  77-83
  二结果  83-98
  三讨论  98-102
  参考文献  102-106
全文小结  106-108
附录  108-109
硕士期间发表论文  109-110
致谢  110-113
统计证明  113

EZH2在肺癌中表达的病理学意义分析

内容摘要

全文目录

相似论文