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血塞通及L-NNA对家兔脑纹状体出血后NOS的影响及其对脑神经元的保护作用

作　者: 王崇甫
导　师: 尹逊河
学　校: 山东农业大学
专　业: 基础兽医
关键词: 兔纹状体脑出血一氧化氮合酶 L-硝基-精氨酸血塞通
分类号: R743.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本试验用兔作为试验动物成功制备了脑出血(ICH)模型，然后分别用血塞通和NOS抑制剂L-NNA对成功模型兔进行比较治疗。通过测定各组兔血清和纹状体内NO含量、NOS活性以及各脑组织内NOS阳性神经元的表达的变化来探讨ICH发病机理与NO的关系，NOS抑制剂(L-NNA)和血塞通对其主要病变部位NO、NOS神经元的影响。运用脑立体定位及微量注射技术将自体动脉血注射入右侧纹状体靶点内，制备脑出血兔模型，并通过行为学及免疫组织化学方法对模型进行检测。行为学检测结果及HE染色镜检显示，本试验制备的兔模型达到成功模型标准。利用硝酸还原酶法和生物化学检测方法分别检测各组兔血清及纹状体内的NO含量及各脑组织内NOS的活性变化。结果显示：模型对照组的血清NO浓度和各脑纹状体内NO含量都显著高于假手术对照组和两个治疗组；血塞通组及L-NNA组上述指标与模型组显著性差异(P<0.05)。NOS活性检测结果显示，各组对应时间点内TNOS活性强弱顺序均为：模型组>血塞通组> L-NNA组>正常及假手术对照组。iNOS活性变化表现为：模型组前期（1d以前）iNOS活性升高不显著(P>0.05)，中后期活性显著升高(P<0.05)；两治疗组iNOS活性变化规律表现为前期与模型组基本一致，1d-7d其活性显著低于模型组(P<0.05)，但较假手术对照组仍有升高，9d时基本恢复至正常组水平，两治疗组之间比较前期（1d以前）L-NNA降低iNOS活性的效果好于血塞通治疗组，后期差异不显著(P>0.05)。利用SABC免疫组织化学法，在光镜下对各组兔术后不同时间内脑纹状体nNOS、iNOS阳性神经元的形态结构及分布进行观测。结果显示：模型组nNOS阳性神经元表达与假手术组比较在3d以前表现为神经元密度逐渐升高，胞体截面积减小，突起长度缩短和第一级突起数量减少，在术后3d达到最低点；随后神经元密度逐渐降低，截面积变大，突起数量增多等。模型组与假手术组比较各项指标在各时间段差异显著（P<0.05）；L-NNA治疗组和血塞通治疗组与模型组比较nNOS阳性神经元密度在1d和3d两个时间段显著性降低（P<0.05），胞体截面积显著增大（P<0.05），最长突起长度和第一级突起数量增加。两治疗组之间各项指标差异不显著（P>0.05）。iNOS阳性神经元的表达与nNOS的表达基本一致，iNOS在前期表达痕量，在脑出血损伤后表达急剧上升，表现为模型组比假手术组iNOS密度的快速升高上；两治疗组与模型组比较iNOS阳性神经元密度在3d、5d和7d较模型组显著降低（P<0.05），9d时差异不显著（P>0.05）。结果表明：模型组脑纹状体内内NO及血清NO含量随着时间的延续，含量持续的增加，到达3d时达到巅峰随后逐渐降低，且在9d左右基本恢复到正常水平。而通过L-NNA和血塞通治疗的家兔脑纹状体NO含量及血清NO含量在各时间段显著低于模型组，且通过检测脑纹状体NOS活性与NO的变化呈正相关。血塞通及L-NNA治疗组6h、1d、3d兔脑组织阳性神经元的数量、胞体截面积及最长突起长度变化显著，神经元细胞核固缩、核溶解等出血变化与相应的脑出血模型组比较显著减轻，只有少数神经细胞出现死亡。L-NNA和血塞通可明显减少死亡神经元的数量，并使神经元的最长突起长度有所增加，治疗效果显著（P<0.05）。实验结果表明：L-NNA和血塞通在脑出血损伤中发挥重要的保护作用。

全文目录

中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1 引言  13-23
  1.1 一氧化氮的概述  13-15
    1.1.1 一氧化氮的生物学特性  13-14
    1.1.2 一氧化氮的生物合成和一氧化氮合酶的分类  14
    1.1.3 一氧化氮合酶在脑内的分布  14-15
  1.2 脑出血的研究进展  15-19
    1.2.1 脑出血后脑损伤机制的研究进展  16-17
      1.2.1.1 炎性反应与脑出血  16-17
      1.2.1.2 自由基与脑出血  17
      1.2.1.3 一氧化氮与脑出血  17
    1.2.2 脑出血模型的研究进展  17-19
      1.2.2.1 自体血注入 ICH 模型  17-18
      1.2.2.2 胶原酶诱导 ICH 模型  18
      1.2.2.3 微球囊充胀 ICH 模型  18
      1.2.2.4 自发性 ICH 模型  18-19
  1.3 血塞通与脑出血  19-22
    1.3.1 活血、利水中药对脑缺血的作用  19-20
      1.3.1.1 清除自由基（OFR）  19
      1.3.1.2 改善血肿周围微循环  19-20
      1.3.1.3 兴奋性氨甚酸的神经毒性作用  20
      1.3.1.4 降低血脑屏障通透性  20
    1.3.2 血塞通的种类  20
    1.3.3 血塞通在脑出血中的药理作用  20-21
      1.3.3.1 抗脑水肿  20-21
      1.3.3.2 抗脑细胞凋亡  21
    1.3.4 血塞通的应用前景  21-22
  1.4 NOS 抑制剂与脑出血  22
  1.5 本课题研究的目的和意义  22-23
2 材料与方法  23-28
  2.1 试验材料  23-24
    2.1.1 试验动物  23
    2.1.2 主要试剂  23
    2.1.3 主要试验仪器  23-24
    2.1.4 试验场地及预备试验  24
  2.2 试验方法  24-28
    2.2.1 分组及其给药方法  24
    2.2.2 动物模型的制备  24
    2.2.3 取材  24-25
      2.2.3.1 家兔血清的分离  24-25
      2.2.3.2 脑样和脑匀浆液的制备  25
    2.2.4 脑切片制作  25
    2.2.5 SABC 免疫组织化学染色  25-26
    2.2.6 切片观察和测量  26
    2.2.7 NO 浓度的测定  26
    2.2.8 NOS 活性的测定  26-27
      2.2.8.1 脑组织蛋白质含量的测定  26-27
      2.2.8.2 NOS 活性测定步骤  27
    2.2.9 数据统计与分析  27-28
3 结果与分析  28-40
  3.1 各组家兔行为学检测结果  28-29
  3.2 各组家兔血清 NO 含量检测结果  29-30
  3.3 各组家兔脑纹状体 NO 含量及 NOS 活性的检测结果  30-33
    3.3.1 各组家兔脑纹状体 NO 含量  30-31
    3.3.2 各组家兔脑纹状体 TNOS 活性检测结果  31-32
    3.3.3 各组家兔脑纹状体 iNOS 活性检测结果  32-33
  3.4 各组家兔脑纹状体 NOS 阳性神经元的变化  33-40
    3.4.1 各组家兔脑纹状体 nNOS 阳性神经元的变化  33-37
      3.4.1.1 nNOS 阳性神经元密度的变化  33-34
      3.4.1.2 各组脑纹状体 nNOS 神经元胞体截面积的变化  34-35
      3.4.1.3 各组脑纹状体 nNOS 神经元最长突起长度的变化  35-36
      3.4.1.4 各组脑纹状体 nNOS 神经元第一级突起数的变化  36-37
    3.4.2 各组家兔脑纹状体 iNOS 阳性神经元的变化  37-40
      3.4.2.1 各组家兔脑纹状体 iNOS 阳性神经元密度的变化  37-38
      3.4.2.2 各组家兔脑纹状体 iNOS 阳性神经元胞体截面积的变化  38-39
      3.4.2.3 各组脑纹状体 iNOS 神经元最长突起长度的变化  39-40
      3.4.2.4 各组脑纹状体 iNOS 神经元第一级突起数的变化  40
4 讨论  40-44
  4.1 用兔作实验动物制备 ICH 模型的优点及意义  40-41
  4.2 各组兔脑组织匀浆 NO 含量及血清 NO 浓度的变化  41
  4.3 各组兔脑脑纹状体 NOS 活性的变化  41-43
  4.4 各组兔纹状体内 nNOS、iNOS 阳性神经元的数量形态变化  43
  4.5 ICH 兔模型中 NO 可能的神经损害机制及血塞通和 L-NNA 对模型兔脑组织内 NOS 的影响  43-44
5 结论  44-46
  5.1 ICH 造模方法  44-45
  5.2 血塞通在脑出血损伤中的保护作用  45
  5.3 L-NNA 在脑出血中的保护作用  45-46
参考文献  46-55
附图  55-63
致谢  63

血塞通及L-NNA对家兔脑纹状体出血后NOS的影响及其对脑神经元的保护作用

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