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NF-κB在孕鼠深静脉血栓血管内皮细胞中的表达及其抑制剂的干预作用

作　者: 叶柳青
导　师: 钟梅
学　校: 南方医科大学
专　业: 妇产科学
关键词: 深静脉血栓核因子-κB 血管内皮细胞炎症吡咯烷二硫代氨基甲酸盐
分类号: R714.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

[研究背景与目的]深静脉血栓(deep vein thrombosis,CVT)是一种常见的血.管血栓性疾病,DVT的急性期容易导致肺栓塞,存在致死性,越来越受到国内外学者的重视。英国学者统计妊娠期DVT发病率为0.05%～0.10%,近年来妊娠期和产褥期深静脉血栓的发病率呈上升趋势。妊娠期由于生理性获得性易栓因素的存在和血液高凝状态是导致其发病率增高的重要原因。目前公认Virchow提出血流滞缓、血液高凝、静脉壁的损伤是静脉血栓形成的三大因素。近年来研究发现炎症与深静脉血栓的形成和发展有着密切关系,炎症反应介导血管内皮细胞损伤,血流淤滞,从而促进静脉血栓形成；血栓的形成加剧炎症反应,两者相互影响。已有大量的病理学和血清炎症与静脉血栓的相互关系提供有力的依据。因此研究静脉血栓发生、发展相关的调控炎症因子的蛋白对于延缓、减轻静脉血栓形成及预后的判断具有重要的意义。核转录因子(nuclear factor-kappaB,NF-κB)是由Sen和Baltimore发现以能与B细胞免疫球蛋白K轻链基因的增强子KB序列(GGGACTTTCC)特异结合而命名。NF-κB是近年来发现重要的转录因子,是细胞中普遍存在的具有多向转录调节作用的序列特异性DNA结合蛋白。NF-KB通常与抑制蛋白(IκB)结合成三聚体,以失活状态存在于细胞浆中,当细胞受到各种刺激原如紫外辐射、细胞因子、活性氧作用时,NF-KB与IKB解离并进入细胞核结合靶基因启动子以激动相应基因的转录。目前已在淋巴细胞激活、败血症、急性炎症反应综合征(AIRS)、肝脏缺血再灌注损伤、肿瘤血管新生方面等疾病中发现NF-κB蛋白的作用。越来越多研究表明在炎症反应复杂的细胞因子网络中,NF-κB的激活可能是一个中心环节。NF-KB在炎症细胞激活的信号调控中起着重要作用,通过活化中性粒细胞、内皮细胞,使细胞释放一系列粘附分子、细胞因子、酶类等介质,介导或直接参与白细胞和血管内皮细胞的相互作用以及组织的损伤。NF-κB控制着炎症及免疫相关基因的表达,这些基因涉及到中毒性休克、急性期反应、辐射损伤、哮喘、风湿性关节炎、动脉粥样硬化、癌症等多种疾病过程,因此可以通过抑制NF-κB转录活性来治疗这些疾病。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)作为NF-κB特异性的抑制剂,理论上可减少NF-κB的核移位进而抑制NF-κB的活化。基于这种思路,探讨NF-κB在静脉血栓发生发展阶段中表达的量化特点及变化规律的研究,是否可通过抑制其活性及相应细胞因子的分泌,改善炎症反应,从而影响血栓的形成。探讨NF-KB激活的信号通路能否作为新型药物靶点的研究方向,为防治深静脉血栓提供初步的理论依据。因此,本实验采用下腔静脉结扎法建立孕鼠深静脉血栓模型,进一步从量化水平探讨深静脉血栓形成后血管内皮细胞中NF-κB蛋白的表达特点,初步分析NF-κB蛋白与深静脉血栓发生发展的关系；分析NF-κB蛋白的表达水平与血栓形成情况的相关关系。本实验使用NF-κB的抑制剂PDTC干预孕鼠,再探讨其干预作用对NF-κB蛋白的表达及形成血栓的大小有何影响。[材料与方法]1、54只SD大鼠购自南方医科大学实验动物中心,常规饲养一周后,以2：1雌性与雄性SD大鼠合笼,各组大鼠孕10-15天行DVT造模,其中48只随机分为血栓模型组、PDTC干预组,根据6h、12h、24h、72h时间点随机分为四个亚组,各点为6只,其余6只为假手术组。2、采用下腔静脉结扎法建立孕鼠深静脉血栓模型,血栓模型组和PDTC干预组在造模前1h分别给予腹腔注射0.9%生理盐水和PDTC(100mg/kg/d),每24h注射1次,72h即注射3次。3、分别在建模后规定的各时间点分批处死动物,称取形成血栓的湿重和测量其长度,比较两组血栓形成情况。静脉血栓组织放至10%中性福尔马林液中固定以备HE染色和免疫组化检测。4、HE染色后,在光镜下观察各组下腔静脉血栓病理形态学改变和炎症细胞的表达,采用免疫组化半定量图像分析法检测各组DVT血管内皮细胞中NF-KB蛋白的表达水平,用Imageproplus图像分析技术测量NF-κB蛋白的阳性单位(Mean optical density,IOD),分析不同时间点组织中NF-KB蛋白表达强度的特点及与DVT之间的关系,分析各组血栓形成情况与NF-KB蛋白表达的相关关系。5、统计学分析：所得的数据用SPSS13.0软件进行处理,各组数据均以平均值±标准差(X±s)表示。采用析因设计的方差分析各组间血栓湿重与长度比值及NF-KB IOD值,同一时间点两组间的比较采用独立样本的t检验,分析各组及组间差异是否有统计学意义。组间相关性分析采用双变量相关分析,服从双变量正态分布资料选择Pearson相关系数。P<0.05表示差异具有统计学意义。[结果]一、孕鼠深静脉血栓模型的建立及检测1、利用结扎法结扎下腔静脉和及其两侧骼腰支,可成功的构建孕鼠深静脉血栓模型。2、建模后各时间点均可见明显的下腔静脉血栓的形成,术后可见形成的红色血栓或混合血栓,血栓质地松软,静脉壁柔软,尚富有弹性,挤压血栓块可从血管壁脱出,静脉壁与周围组织无明显粘连。术后72h形成层状血栓,血栓质地较硬,静脉壁较韧,静脉壁与周围组织粘连紧密。随着时间延长,形成血栓湿重与血栓长度比值增加。3、HE染色光镜下观察术后6h、12h可见形成的红色血栓为主,24h形成的混合血栓为主,72h可见层状血栓的形成,静脉血栓血管壁周围伴随着炎症细胞增多,明显炎症反应,炎症细胞以24h、72h明显增多。二、深静脉血栓血管内皮细胞中NF-κB蛋白表达的定量分析1、正常孕鼠血管内皮细胞中NF-κB表达弱,NF-κB蛋白的IOD值以DVT形成后6h开始升高,24h达高峰,72h后下降。2、NF-κB p65蛋白的IOD值(0.72±0.23)在血栓血管内皮细胞中与正常血管内皮细胞(0.12±0.04)中的表达差异有统计学意义(t=-6.379,P=0.000)。三、PDTC干预DVT后形成的血栓湿重与血栓长度的比值情况血栓模型组形成的血栓湿重与长度比值显著高于PDTC干预组(F=5.755,P=0.021),PDTC药物干预后不同时间点形成血栓湿重与血栓长度比值有显著差异(F=4.394,P=0.009)。PDTC干预72h后血栓湿重与血栓长度比值显著低于血栓模型组(P=0.047),而在6h、12h、24h时间点中血栓湿重与长度比值相比无显著性差异(P>0.05)四、PDTC干预DVT后血管内皮细胞中NF-KBp65的表达情况1、PDTC干预组静脉血管内皮细胞中NF-KB平均光密度值均明显低于血栓模型组(F=17.276,P=0.000),PDTC干预后不同时间点NF-κB平均光密度值有显著性差异(F=15.685,P=0.000)。2、应用PDTC干预后NF-KB蛋白的表达水平较血栓模型组下降,但以PDTC干预12h(P=0.046)、24h(P=0.044)、72h(P=0.016)后NF-KBp65平均光密度值明显低于血栓模型组,差异有统计学意义。五、深静脉血栓血管内皮细胞中NF-KB蛋白与血栓大小的相关性分析正常静脉内皮细胞、血栓模型组和PDTC干预组相比较,三者中NF-κB蛋白表达的强度差异有统计学意义(F=28.704,P=0.000)；深静脉血栓血管内皮细胞中NF-κB蛋白的表达水平与血栓湿重/长度比值大小呈正相关(r=0.392,P=0.006)。[结论]一、应用下腔静脉结扎法成功的构建了孕鼠深静脉血栓模型,并于6h、12h、24h、72h观察到不同时间段的血栓形成和静脉血管壁周围的炎症反应,表明炎症参与静脉血栓的发生发展。二、NF-κB蛋白在正常静脉内皮细胞中低表达,在血栓血管内皮细胞中表达明显增强,提示深静脉血栓形成后NF-κB蛋白明显激活。NF-κB的抑制剂PDTC干预DVT后NF-κB蛋白的表达水平明显下降,炎症反应减轻。三、NF-KB蛋白表达水平与深静脉血栓湿重/长度比值大小呈正相关,说明NF-κB蛋白的激活与深静脉血栓的发生发展密切相关。四、NF-κB的抑制剂PDTC干预DVT后可使血栓湿重与长度比值减小,一定的程度上减轻静脉血栓的形成,但可能存在时效性和剂量差异；推测机制可能与PDTC抑制血管内皮细胞中NF-κB的信号传导通路,从转录因子的水平调控抑制其炎症反应,减轻血管壁损伤有关。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-15
前言  15-19
技术路线  19-20
第一部分孕鼠深静脉血栓模型的建立及检测  20-26
  一、实验材料  20-21
  二、实验方法  21-22
  三、结果  22-24
  四、讨论  24-26
第二部分 NF-κB在孕鼠深静脉血栓血管内皮细胞中的表达及其抑制剂的干预作用  26-42
  一、实验材料  26-27
  二、实验方法  27-29
  三、结果  29-35
  四、讨论  35-42
全文小结  42
本研究存在的问题和不足之处  42-43
参考文献  43-51
附录  51-53
综述  53-60
  参考文献  57-60
硕士期间发表论文  60-61
致谢  61-63
统计合格证明  63

NF-κB在孕鼠深静脉血栓血管内皮细胞中的表达及其抑制剂的干预作用

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