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不育男性精子H19及MEST印记基因甲基化初步研究

作　者: 张伟娜
导　师: 陆军; 刘睿智
学　校: 东北师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 男性不育 H19 MEST 甲基化印记
分类号: R698.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 3次
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内容摘要


男性不育受遗传、环境等多因素影响。70%以上的男性不育病因不明，即使在已知病因的男性不育中，其发病机制尚未完全阐明，因此男性不育诊治有其复杂性与特殊性。其中异常的表观遗传修饰可能是促使男性不育的一个机制。DNA甲基化标志，是印记基因的一个关键修饰。在精子形成过程中，经历原始生殖细胞甲基化的广泛擦除和受精后精原细胞甲基化的重新建立。印记基因DNA甲基化异常与男性不育有关。为研究DNA甲基化与男性不育的关系，我们比较了正常生育男性与少弱畸形精子症患者父系印记基因H19DMR及母系印记基因MEST DMR DNA甲基化差异。首先对所研究标本进行精液常规分析和精子形态分析，密度梯度离心法提纯精液，然后提取精液基因组DNA并进行亚硫酸氢盐处理。利用PCR体外扩增并将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接及酶切验证，并对阳性克隆进行测序和DNA甲基化程度差异分析。结果表明，所有正常生育男性H19DMR DNA是高甲基化的，甲基化率为100%，少弱畸形精子症患者DNA甲基化水平显著下降，甲基化率为93.05%，结果比较有显著性差异（P＜0.01），同时在少弱畸形精子症患者中CpG位点1、CpG位点3和CpG位点6平均甲基化率与精液正常组相比有显著性差异（P＜0.05）。所有正常生育男性MESTDMR DNA是低甲基化的，甲基化率为1.62%，少弱畸形精子症患者DNA甲基化水平有所升高，甲基化率为4.03%，结果比较差异无显著性（P＞0.05），同时在比较二者每一个CpG位点平均甲基化率时，差异仍无显著性（P＞0.05）。综上所述，我们得到的结论是H19印记基因的甲基化异常和男性不育有关，它可能成为人类精子形成缺陷的一个生物标志。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-6
目录  6-8
第一部分 引言  8-15
  一、 男性不育的概念及其相关研究进展  8
  二、 基因组印记研究概况  8-13
    （一） 基因组印记概念及发现  8-9
    （二） 基因组印记的相关理论  9
    （三） 基因组印记与甲基化  9-12
    （四） 基因组印记与动物生长发育  12-13
  三、 本文研究的内容和意义  13-15
    （一） 立题依据  13-14
    （二） 本文研究的内容和意义  14-15
第二部分 实验材料与方法  15-22
  一、 实验材料  15-16
    （一） 研究对象及分组  15
    （二） 主要试剂  15
    （三） 实验仪器  15-16
  二、 实验方法  16-22
    （一） 精液样本的处理  16
    （二） 精液提纯  16
    （三） 精子 DNA 提取  16-17
    （四） 精子 DNA 甲基化修饰  17-18
    （五） DNA 扩增  18-19
    （六） PCR 产物验证  19
    （七） PCR 片段回收  19-20
    （八） 连接  20
    （九） 转化  20
    （十） 质粒 DNA 的小量提取  20-21
    （十一）酶切验证  21
    （十二）PCR 产物克隆测序  21
    （十三）统计分析  21-22
第三部分 实验结果与分析  22-31
  一、 MEST 基因 DMR PCR 扩增  22
  二、 H19 基因 DMR PCR 扩增  22-23
  三、 MEST 基因 DMR 阳性克隆鉴定  23-24
  四、 H19 基因 DMR 阳性克隆鉴定  24
  五、 H19 基因 DMR 和 MEST 基因 DMR CpG 位点整体甲基化状态分析  24-27
    （一） H19 DMR CpG 各位点甲基化状态的点状图  24-25
    （二） H19 DMR CpG 位点整体甲基化状态分析  25-26
    （三） MEST DMR CpG 各位点甲基化状态点状图  26-27
    （四） MEST DMRCpG 位点整体甲基化状态分析  27
  六、 H19 DMR 和 MEST DMR CpG 各位点平均甲基化率比较分析  27-31
    （一） H19 DMR CpG 各位点平均甲基化百分率比较分析  27-28
    （二） MEST DMR CpG 各位点甲基化百分率比较分析  28-31
第四部分 讨论  31-33
  一、 H19 DMR 甲基化异常是人类精子形成缺陷的一个生物标志  31-32
  二、 MEST 甲基化异常与中国男性精子形成异常无关  32-33
第五部分 主要结论  33-34
参考文献  34-40
附录一  40-41
附录二  41-42
致谢  42-43
学期间公开发表论文及著作情况  43

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 泌尿科学（泌尿生殖系疾病） > 男子性机能障碍 > 男性不育症
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