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多孔丝素蛋白和骨髓间充质干细胞联合修复兔股骨头早期坏死的实验性研究

作　者: 刘春光
导　师: 齐志明
学　校: 大连医科大学
专　业: 骨科学
关键词: 股骨头缺血性坏死 丝素蛋白 骨髓间充质干细胞 支架材料
分类号: R681.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：骨髓间充质干细胞体外分离、培养和扩增技术在实验阶段已经基本成熟并且在临床部分已经逐步并开始应用，但是尚未能找到其合适的载体，不便于临床的实际应用。为了提高骨髓间充质干细胞在临床应用的疗效，实验拟骨髓间充质干细胞联合丝素蛋白及骨髓间充质干细胞移植对股骨头早期坏死的修复作用。为临床提供理论依据和合理的治疗方法。方法：1.实验前准备及实验动物的分组：实验动物提前一周饲养以适应环境及观察确定无疾病。术前一天禁食水。18只成年新西兰大耳白兔，随机分为A、B、C三组，每组6只，A组为骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs）联合丝素蛋白（silk fibroin,SF）移植组，B组为BMSCs移植组，C组为空白对照组。两组于术后2，4，8周各处死2只实验动物。2. BMSCs获取培养及复合载体：术前1周从成年新西兰大耳白兔髂后上嵴处抽取骨髓，种植于6孔细胞培养板内，培养液为含20%胎牛血清DMEM液，放入细胞培养箱内培养，传代密度为1×106/cm2。第3代细胞培养至传代密度时制成细胞悬液，A组分别浸润每个10mm×5mm×5mm大小SF，放入细胞培养箱内培养，24小时后手术植入实验动物股骨头钻孔处；B组则分别浸润分成和SF一样大小的明胶海绵颗粒，放入细胞培养箱内培养24小时后，手术将载有BMSCs的明胶海绵均匀混合并植入实验动物股骨头钻孔处。C组不做任何处理。3.实验动物模型制备及手术方法：所有动物右侧股骨头参加实验。取俯卧位，40mg/kg氯胺酮静脉注射麻醉。常规消毒，铺单。髋关节后侧切口，显露股骨头，不切断圆韧带，髋关节不脱位，保护周围组织，用液氮棉团连续冷冻股骨头3分钟造成股骨头坏死模型。自然复温后从股骨颈内后侧向股骨头内钻孔，用直径3.5mm钻头向股骨头内钻入4mm，到达关节软骨下。A组钻孔后植入复合BMSCs的SF，关闭伤口。B组钻孔后植入复合BMSCs的明胶海绵，关闭伤口。C组为单纯造模组。4. HE染色：取出10%福尔马林中保存的股骨头标本，从股骨颈基底锯断，将标本做标记后放入8%甲酸溶液中换液三次，共脱钙两周。脱水、透明、浸蜡、修块，做5μm切片，水浴，铺片，烤片。然后行HE染色：熔蜡，酒精梯度水化，亚甲兰染色，酸化，返兰，伊红染色，再酒精梯度脱水，透明。然后光学树脂封片。5. X线及组织学观察：X射线观察钻孔区骨密度及骨小梁的变化情况。苏木精-伊红染色切片，光镜观察钻孔区细胞及骨小梁的变化情况。6.统计学方法：采用SPSS13.0统计学软件，对缺损区新生骨小梁图像，进行面积百分比均值的t检验分析。结果：1.股骨头X线检查：A组2周标本，钻孔区可见股骨头中部植入复合BMSCs的SF部位有明显的高密度区，骨小梁结构完整。4周标本，钻孔区高密度部分密度略减，钻孔区以外密度有所增加，骨小梁结构完整。8周标本，内植SF部分密度基本正常，出现骨小梁，钻孔区界限进一步模糊。钻孔缺损区以外密度有所增加，骨小梁紊乱，出现软骨下囊性变。B组2周标本，股骨头密度有所增加。4周标本骨小梁结构仍完整。8周标本，股骨密度增高，骨小梁结构紊乱，软骨下囊性变。C组钻孔区X线表现与B组随时间变化大致一致。从总体上看，A组缺损区因植入完整的SF，故密度逐渐降低最后出现正常骨小梁结构。B组缺损区植入明胶海绵联合BMSCs，密度由开始降低后升高，最后出现软骨下囊性变。2.股骨头的组织检查：A组术后2周时，钻孔缺损区内有大量的成骨细胞，缺损区边缘有较多的类骨质和新生骨小梁。4周时缺损区内有大量骨小梁形成及类骨质填充。在8周时缺损区内骨小梁趋于成熟，并有大量骨髓组织形成。B组实验动物的股骨头标本术后2周时，标本缺损处有大量的成骨细胞，钻孔边缘形成较多的类骨质及骨小梁。4周时钻孔区已经被新生骨小梁填满。8周标本形成正常骨小梁和骨髓组织。C组术2周后标本出现软骨、骨髓和骨修复现象，软骨修复有两种来源，一种是从滑膜和圆韧带来源的梭形软骨细胞，一种是来源于关节软骨增生层的软骨细胞，位于软骨囊内，呈椭圆形或圆形。骨修复表现两种方式，一种是骨小梁周围出现同位附加骨，一种是骨髓腔以膜内化骨或软骨化骨形式出现骨小梁。4周后修复作用增强，部分坏死骨小梁开始吸收，出现较多破骨细胞，骨小梁不规则，出现骨折，关节软骨面磨损加重，少数标本关节软骨面塌陷。8周时关节软骨面磨损与修复并存，骨髓纤维化和增生互见，髓腔膜内化骨和骨小梁同位附加骨增多，骨小梁紊乱变细，骨吸收和骨折加重。结论：1全骨髓培养法是获得骨髓基质干细胞的良好办法，骨髓基质干细胞具有良好的体外诱导成骨的特性。2髋关节不脱位液氮冷冻法可成功的制造股骨头缺血性坏死模型。3.BMSCs复合SF有很好的成骨作用，无细胞诱导因子亦可良好成骨。4.SF可以作为BMSCs良好的支架材料。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-11
前言  11-12
材料和方法  12-16
结果  16-18
讨论  18-26
结论  26-27
参考文献  27-30
综述  30-40
  参考文献  37-40
附录  40-45
致谢  45-46

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 骨科学（运动系疾病、矫形外科学） > 骨骼疾病 > 下肢骨
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