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经动脉灌注LV-mIL12转染大鼠带蒂SIEA皮瓣对在体乳腺癌SHZ-88细胞生长影响的研究

作　者: 崔雅宁
导　师: 乔群; 王晓军
学　校: 北京协和医学院
专　业: 整形外科
关键词: 基因治疗腹壁浅动脉皮瓣白介素12 慢病毒经动脉灌注
分类号: R737.9
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

基因治疗作为一种前沿的治疗手段在肿瘤治疗中发挥重要作用,而靶向基因治疗由于其良好的、有效的定向治疗作用,极低的全身反应,成为目前基因治疗研究的热点。皮瓣是整形外科的常用工具,在难愈性创面及体表肿瘤切除后的修复重建过程中发挥重要作用。通过对皮瓣进行基因修饰,使其在肿瘤创面修复中兼具抗肿瘤作用,是整形外科领域的进一步拓展。目前应用皮瓣的靶向基因治疗在整形外科领域的研究刚刚起步,相关文献报道较少。本课题在大鼠带蒂腹壁浅动脉皮瓣(Superficial inferior epigastric artery flap, SIEA flap)模型的基础上,深入探讨慢病毒载体(Lentivirus, LV)介导外源基因增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)经动脉介入灌注转染复合组织瓣的可行性、安全性并对其转染条件作出评价,并首次将抗肿瘤因子白介素12与慢病毒载体结合,经动脉灌注于皮瓣中,转移于局部肿瘤创面,观察其抗肿瘤效果。本课题由以下四个部分组成：1、大鼠带蒂SIEA皮瓣经动脉灌注模型的制备根据我们的前期研究结果,通过灌注美兰对大鼠SIEA皮瓣血供系统进行进一步确认、研究,设计完善的手术步骤。设计大鼠带蒂SIEA岛状皮瓣,通过暂时夹闭其它分支血供,形成一封闭回路,并经SIEA灌注PBS观察对皮瓣存活的影响。结果显示,当皮瓣缺血时间在120min时,经此操作灌注PBS术后SIEA皮瓣愈合正常,光镜下检测中性粒细胞计数与对照组相比无显著差异(P>0.05)。2、慢病毒载体介导示踪基因EGFP (LV-EGFP)经动脉灌注转染大鼠带蒂SIEA皮瓣的研究体外转染皮瓣中的主要成分细胞：大鼠主动脉内皮细胞(Rat aortic endothelial cell, RAEC)、大鼠的皮肤成纤维细胞(Rat dermal fibroblast, RDF)、人的皮肤成纤维细胞(Human dermal fibroblast, HDF)、人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC),观察不同时间、不同感染复数(Multiplicity of infection, MOI)下的转染效率和基因表达水平,寻找最佳转染复数及转染时间。结果显示,对于HDF、 HUVEC, LV-EGFP在MOI=50即可有50%以上感染率,在MOI=200时感染率可达到80%以上。对于RDF和RAEC,在MOI=200时可有70%感染率。因此,在MOI=200时对所有的细胞均具有较高的感染率,且不影响细胞活力。对于HDF和HUVEC,在MOI=200时感染2h即可达到满意效果。对于RDF和RAEC感染时间越长越好(12h之内),感染2h基本可以保证感染率在50%以上。慢病毒介导EGFP经动脉灌注转染大鼠带蒂SIEA皮瓣的研究：实验大鼠依据不同灌注液：LV-EGFP (1.0×108TU/ml、5.0×108TU/ml、1.0×109TU/ml)、PBS,随机分为4组。按第一部分所诉,经动脉灌注转染大鼠带蒂SIEA皮瓣120min。术后第7、14、21、28、40天对外源基因在各组SD大鼠带蒂SIEA皮瓣的表达和分布情况进行评价。结果显示：PBS(A组)和LV-EGFP1.0×108TU/ml(B组)、LV-EGFP5.0×108TU/ml (C组)不能有效转染皮瓣。1.0×109TU/ml (D组)可以有效转染皮瓣,在术后40天仍有表达,对肝、肾无影响。3、目的基因mIL12(murine Interleukin-12, mIL12)过表达慢病毒载体构建及功能检测选取具有抗肿瘤作用的IL12作为目的基因,以pORF-mIL-12为模板,PCR调取目的基因,与表达载体重组,采用三质粒慢病毒包装系统构建重组白介素12慢病毒(LV-mIL-12).以构建好的LV-mIL-12感染人及大鼠皮肤成纤维细胞(HDF、RDF)、血管内皮细胞(HUVEC、RAEC),检测mIL-12过表达及生物活性。结果显示：成功构建了白介素12重组慢病毒包装质粒,能在细胞内表达。LV-mIL-12可以有效感染皮瓣的主要几种细胞,并分泌有生物活性的mIL-12。4、LV-mIL12经动脉灌注转染大鼠带蒂的SIEA皮瓣对大鼠SHZ-88乳腺癌细胞的影响行大鼠SHZ-88乳腺癌细胞皮瓣皮下接种法建立大鼠乳腺癌模型,将SD大鼠经动脉灌注液不同：LV-mIL12、LV-EGFP、PBS随机分为三组。按前文所述制备SIEA岛状皮瓣,经动脉灌注不同灌注液,分别于术后的第1~40天,观察负瘤鼠生长情况、SIEA皮瓣成活情况及局部瘤体生长情况。结果显示：在术后的28天,ELISA检测实验组皮瓣中央及皮瓣周围均有mIL12表达,皮瓣中央处表达量>皮瓣周围>对照组。经动脉灌注LV-mIL12转染大鼠带蒂SIEA皮瓣在早期(7~15天)抑制了局部肿瘤细胞的生长。但到第20天后肿瘤生长实验组与对照组基本持平,肿瘤体积不再明显长大。综上所述,本实验建立了操作简便、稳定的大鼠带蒂SIEA皮瓣经动脉灌注研究模型。证实慢病毒载体可以携带外源基因EGFP经动脉灌注转染大鼠带蒂SIEA皮瓣。通过三质粒包装法成功构建了白介素12重组慢病毒包装质粒,构建的LV-mIL-12可以有效感染皮瓣的主要几种细胞,并分泌有生物活性的mIL-12。LV-mIL-12经动脉灌注大鼠带蒂SIEA皮瓣,可以在皮瓣及其周围组织中表达。LV-mIL12转染的大鼠带蒂SIEA皮瓣在早期(7~15天)抑制了局部肿瘤细胞的生长。

全文目录

缩略词中英文对照表  5-7
中文摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
前言  12-13
文献综述基因治疗在整形外科中的应用  13-20
  1 基因导入系统  13-16
  2 基因导入方法  16
  3 整形外科中的基因治疗  16-20
第一部分大鼠带蒂SIEA皮瓣经动脉灌注模型的制备  20-28
  1 实验材料  20-21
  2 实验方法  21-24
  3 术后观察及取材  24
  4 统计学处理  24
  5 结果  24-25
  6 讨论  25-27
  7 结论  27-28
第二部分慢病毒载体介导EGFP经动脉灌注转染大鼠带蒂SIEA皮瓣的研究 #26携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体分别对体外培养大鼠主动脉内皮细胞、皮肤成纤维细胞,人的血管内皮细胞、皮肤成纤维细胞转染效率的观察  28-45
  携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体（LV-EGFP)分别对体外培养大鼠主动脉内皮细胞、皮肤成纤维细胞，人的血管内皮细胞、皮肤成纤维细胞转染效率的观察  28-35
    1 实验材料与方法  28-29
    2 不同感染复数下LV-EGFP对体外培养大鼠主动脉内皮细胞、皮肤成纤维细胞，人的血管内皮细胞、皮肤成纤维细胞转染效率的观察  29-30
    3 不同感染时间下LV-EGFP对体外培养大鼠主动脉内皮细胞、皮肤成纤维细胞，人的血管内皮细胞、皮肤成纤维细胞转染效率的观察  30
    4 统计学处理  30
    5 结果  30-33
    6 讨论  33-35
    7 结论  35
  LV-EGFP经动脉灌注大鼠带蒂的SIEA皮瓣的研究  35-45
    1 实验材料  35-36
    2 实验方法  36
    3 术后检测方法  36-38
    4 结果  38-42
    5 讨论  42-44
    6 结论  44-45
第三部分目的基因mIL12过表达慢病毒载体构建及功能检测  45-65
  mlL12过表达慢病毒载体构建  45-58
    实验流程  45
    材料与方法  45-55
    结果  55-58
    讨论  58
    结论  58
  目的基因(LV-mIL12)功能检测  58-65
    材料与方法  58-61
    结果  61-62
    讨论  62-64
    结论  64-65
第四部分 LV-mIL12经动脉灌注转染大鼠带蒂的SIEA皮瓣对大鼠SHZ-88乳腺癌细胞的影响  65-74
  大鼠乳腺癌模型的建立  65-68
    材料与方法  65-67
    结果  67
    讨论  67
    结论  67-68
  LV-mIL12经动脉灌注转染大鼠带蒂的SIEA皮瓣对大鼠乳腺癌细胞的影响  68-74
    材料与方法  68-70
    结果  70-72
    讨论  72-73
    结论  73-74
全文总结  74-75
参考文献  75-83
致谢  83-84

经动脉灌注LV-mIL12转染大鼠带蒂SIEA皮瓣对在体乳腺癌SHZ-88细胞生长影响的研究

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