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Tsc1基因在小鼠血管发育和肺发育中的调控机制研究

作　者: 马爱平
导　师: 蔡柏蔷
学　校: 北京协和医学院
专　业: 呼吸内科学
关键词: 结节性硬化症结节性硬化基因1 条件性基因敲除血管形成表面活性蛋白C Cre/Loxp系统肺泡上皮细胞细胞特异性敲除
分类号: R563
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景：结节性硬化症(Tuberous Sclerosis Complex,TSC)是由于抑癌基因TSC1或TSC2突变引起的常染色体显性遗传病。TSC1/TSC2构成的异二聚体复合物是雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的负性调节因子。该复合物的突变可导致下游mTOR信号通路的活化。mTOR的活化是TSC的主要发病机制,在临床上常有癫痫、智力减退、面部血管纤维瘤等常见症状,此外还可并发心脏错构瘤,肺血管平滑肌瘤,肾脏血管肌脂瘤和肝血管瘤等血管相关症状。但目前对TSC患者血管受累的研究仍较少,血管受累在TSC病变进展中的作用尚未清楚。目的：为了探讨TSC1/2-mTOR信号通路在TSC相关血管形成与胚胎发育的生理作用。运用Cre/LoxP条件性基因敲除技术使小鼠血管内皮细胞Tsc1基因缺失,构建血管内皮细胞mTOR活化模型,阐明TSC血管受累的病变机理。方法和结果：血管内皮细胞Tsc1基因敲除后内皮细胞mTOR过度活化。突变小鼠可出现严重的心血管缺陷并死于胚胎期的第14.5天。这些异常的表型缺陷主要包括皮下水肿、出血和血管形成缺陷。全胚胎免疫组化和病理形态分析表明与同窝对照相比,突变胚胎血管分级不精细,血管走行紊乱,外周血管数目严重减少,血管成熟不完善。并伴心脏受累,心肌小梁发育不良、心室壁变薄。另外,Tscl突变的胚胎血管内皮细胞增殖与凋亡调控异常,凋亡细胞数明显增多,正常发育所需的增殖受影响。同时,血管形成相关的细胞生成因子表达水平与正常对照相比有显著差异。电镜分析显示异常的血管内皮细胞还伴有内质网结构的扩张。为逆转以上血管缺陷,我们在血管发育E12-13天使用雷帕霉素预治疗,结果发现通过降低mTOR的活性,挽救了心血管缺陷和胚胎的致死性并能显著改善突变胚胎生存期,使Tie2-Cre/Tsc1-/-小鼠在出生后存活,最长者可达到出生后22天。虽能存活,但基因突变的小鼠伴有严重的发育不良,部分突变小鼠在刚出生时与同窝对照相比无明显差别,而随其正常的生长发育,Tie2-Cre/Tsc1-/-小鼠发育缓慢体重较野生型显著减少,最终全身消瘦而死亡。结论：TSC1/2-mTOR信号通路对血管发育和胚胎形成起至关重要的作用。通过上调mTOR信号能够干扰正常的血管形成过程。对TSC的血管受累的研究有助于深入了解肾脏血管肌脂瘤和肺淋巴管肌瘤病等血管受累的发病机理。肺泡Ⅱ型上皮细胞(ABCⅡ s)对于维持肺的生理和病理功能有至关重要的作用。AECⅡ s被认为是肺泡Ⅰ型上皮细胞(AEC Ⅰ s)的祖细胞并具有调节免疫功能的作用。AECⅡ s的功能障碍与多种肺疾病有关,但其具体调控机制仍未清楚。因此有必要建立肺上皮转基因工具鼠模型。已有多种研究显示可诱导Cre转基因表达系统被应用于研究靶基因在AECⅡ s功能的模型中,如(SPC-rtTetO-Cre, SPC-Cre-ERT2)。尽管如此,某些局限性的存在限制了目的基因在这些系统中的研究。非诱导条件性Cre基因表达系统是研究正常肺发育和肺部疾病较好的工具模型。虽然SPC-Cre在先前的研究中己被应用,但是该小鼠的具体制作过程尚未报道过。另外,有研究指出SPC-Cre可并有肺大泡表型缺陷,因此,SPC-Cre未能被广泛应用于疾病模型。在本研究中,我们通过原核注射制作了C57BL/6J背景的SPC-Cre小鼠。为检测Cre重组酶在AECⅡ s细胞中的特异性活性,SPC-Cre小鼠分别与ROSA26R报告小鼠和Tsclfx/fx小鼠杂交。X-Ga1染色和PCR分析结果显示β-半乳糖苷酶的蓝染细胞表达在SPC-Cre/ROSA26R的AECⅡ s细胞中,在SPC-Cre/Tscl-/-小鼠的肺组织中可检测到Tsc1的突变带。因此它是研究AECⅡ s细胞在肺发育和肺相关疾病中的有用工具。另外对SPC-Cre/Tscl-/-小鼠肺发育的初步研究发现,SPC-Cre/Tscl-/-小鼠大体形态表型与正常小鼠相似。但病理学分析显示突变小鼠肺泡腔扩增,肺泡间隔数减少。参与肺发育的转录因子水平与同窝对照相比表达调控异常,但具体的调控机制还需更深入的研究。

全文目录

缩略语表  4-6
第一章血管内皮细胞Tscl基因敲除小鼠血管形成缺陷的机制研宄  6-87
  摘要  7-8
  Abstract  8-10
  前言  10-14
  实验流程图  14-15
  第一部分：血管内皮细胞Tsc1基因敲除小鼠可导致胚胎期死亡  15-26
    材料与方法  15-19
    结果  19-22
    讨论  22-25
    结论  25-26
  第二部分：小鼠血管内皮细胞Tsc1基因敲除可引起血管形成缺陷  26-59
    材料与方法  26-38
    结果  38-51
    讨论  51-58
    结论  58-59
  第三部分：雷帕霉素治疗可改善Tie2-Cre/Tsc1~(-/-)的心血管缺陷和胚胎致死性  59-79
    材料与方法  59-61
    结果  61-65
    讨论  65-68
    结论  68-69
    参考文献  69-79
  文献综述  79-87
    参考文献  84-87
第二章肺泡型上皮细胞Tscl缺失小鼠肺发育的调控机制研究  87-112
  摘要  88-90
  Abstract  90
  前言  90-92
  材料与方法  92-99
  结果  99-105
  讨论  105-108
  结论  108-109
  参考文献  109-112
致谢  112-113
个人简历  113-115

Tsc1基因在小鼠血管发育和肺发育中的调控机制研究

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