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三种氧化剂对阿萨希毛孢子菌生长发育影响的研究

作　者: 宗丽娜
导　师: 杨蓉娅
学　校: 山西医科大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 阿萨希毛孢子菌氧化应激活性氧介质氧化剂形态学
分类号: R756
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究背景毛孢子菌属于半知菌、芽生菌纲、隐球酵母目、隐球酵母科，在自然界中广泛存在，是皮肤、口腔、指甲的正常寄生菌。它可引起浅部感染，如毛发、皮肤、指甲的白毛结节病和免疫缺陷患者的系统性或播散性感染，主要见于恶性肿瘤、呼吸功能不全、慢性肾功能不全、血液病、糖尿病、肝硬化或艾滋病患者。其主要风险因素有：抗生素、免疫抑制剂、肾上腺皮质激素、细胞毒性药物的使用，以及各种医疗操作如机械通气、静脉插管、导尿术、器官移植、手术操作或持续性腹膜透析等[1-4]。目前尚有关于健康者感染此病原菌导致系统性感染的报告[5-8]，阿萨希毛孢子菌是其重要致病菌。阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T.asahii）所致播散性毛孢子菌病的临床研究中发现，尽管使用抗真菌药物，但感染仍持续存在。由于该菌的致病机制、毒力基因与耐药机制等方面的研究目前尚不清楚，且该菌对绝大多数的抗真菌药均耐药，一旦该菌在机体造成了播散性、系统性感染，死亡率很高[9]。因此，探索该菌侵袭及感染机制，显得尤为重要。目前，已经用于临床或正在研究的抗真菌药物主要作用于真菌细胞膜、细胞壁、线粒体、影响核酸和蛋白质合成及功能[10、11]。在上述药物中，有的药物因耐药或毒副作用在临床应用受到很大限制，个别新近上市的药物价格太高病人难以接受。近年来，氧化应激机制在抗真菌药的研究方面受到关注。比如：白念珠菌的抗菌机制研究，通过诱导氧化应激反应杀伤真菌是目前某些抗真菌药物的作用机制之一[12-14]。真菌病原体侵入机体后，首先面临的是机体固有免疫系统的防御，诱导机体进入氧化应激状态。吞噬细胞释放大量活性氧介质（ROS），包括过氧化氢、超氧阴离子、羟自由基、过氧化物等；ROS和其他细胞因子共同作用使被吞噬的病原真菌经受致死性打击，病原菌被清除[15]。ROS的损伤作用对清除病原菌极为重要，而病原菌通过形态改变耐受氧化损伤的能力增强可能导致其免疫逃逸。由此看来，利用ROS和氧化应激反应可能成为抗真菌的有效途径之一。研究目的本课题应用三种氧化剂模拟体内氧化应激环境，分别在肉眼、光镜、扫描电镜下观察H2O2、二酰胺和甲萘醌三种氧化剂对阿萨希毛孢子菌临床分离株与环境分离株生长发育的影响。研究方法1．以临床分离株（菌株号：CBS2479）和环境分离株（菌株号：CBS8904）T.asahii（均购自荷兰CBS公司）为研究对象，配制菌悬液，分别接种在加入不同浓度H2O2、二酰胺、甲萘醌的PDA混合培养基上培养5天，肉眼观察三种氧化剂对两株菌菌落生长情况的影响，并与空白对照相比较。2．临床分离株和环境分离株T.asahii分别接种在加入三种氧化剂与液体YPD混合培养基中，振荡培养3天，乳酸酚棉蓝染色观察，光镜下观察形态变化，生长发育情况，并与空白对照相比较。3．把临床分离株和环境分离株T.asahii分别接种在加入不同浓度三种氧化剂的PDA混合培养基上培养48h，挑取一团菌落，制成扫描电镜标本，在扫描电镜下观察形态变化，并与空白对照相比较。结果1.肉眼观察，临床分离株和环境分离株T.asahii在加入不同浓度梯度三种氧化剂的PDA混合培养基上生长情况不同，随氧化剂浓度的增加，菌落直径减小，当氧化剂浓度增大到一定数值时，菌株不再生长，三种氧化剂对环境分离株的影响较大，同一氧化剂相同浓度条件下菌落直径较临床分离株小。2.光镜观察，不同浓度的三种氧化剂对临床分离株和环境分离株T.asahii有明显的影响，与空白对照相比较，可见大量发育不全未着色发亮的小孢子以及细胞碎片，偶可见胞壁皱缩的较大孢子，几乎未见菌丝，而空白菌株见许多菌丝；随培养时间的延长，发育不全的孢子未见明显变化。3.扫描电镜观察，临床分离株空白对照可见大量的菌丝，表面不光滑，有皱褶，直径约2μm；环境分离株空白对照见大量链状孢子、关节孢子，表面有绒毛，孢子直径约3μm。三种氧化剂对两株菌形态均有影响，临床分离株出现部分菌丝胞壁破坏，胞质外溢，菌丝表面皱褶消失、光滑，体积缩小，偶可见整个菌丝完全被破坏。环境分离株出现胞壁凹陷、萎缩、破坏，胞质外溢，表面绒毛消失。甲萘醌对两株菌影响最大，二酰胺次之，H2O2最小。结论氧化剂浓度越高，临床分离株和环境分离株T.asahii数量越少，浓度达到一定数值后，两株菌不再生长。三种氧化剂影响临床分离株和环境分离株T.asahii的生长发育，有菌丝状态转为孢子状态倾向，对环境分离株影响更大一些；三种氧化剂中，甲萘醌对两株菌作用效果最强，二酰胺次之，H2O2最小。推测T.asahii内存在抗氧化机制，当氧化作用超过抗氧化作用时，菌株数量减少，或不再生长。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-10
英文缩略词表  10-11
前言  11-14
  技术路线  13-14
材料与方法  14-19
  1 材料  14-15
  2 方法  15-19
结果  19-26
讨论  26-29
结论  29-30
参考文献  30-34
综述一宿主氧化损伤及致病真菌抗氧化损伤机制的研究进展  34-41
  参考文献  38-41
综述二 AP-1 样转录因子在致病真菌氧化应激作用中的研究进展  41-47
  参考文献  45-47
作者简介  47-48
致谢  48

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