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HBsAg特异性核酸适配体的筛选

作　者: 王晓清
导　师: 张伟华; 廖世奇
学　校: 兰州大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 核酸适配体 SELEX 筛选 ELISA
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 218次
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内容摘要

核酸适配体是一种非天然结构、能折叠的单链核酸,能捕捉特定的分子。它是利用指数富集的配基系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX技术),从随机寡聚核苷酸文库中筛选获得的一种具有分子识别能力的核酸类抗体。核酸适配体具有靶分子范围广、灵活性强、制备简单快速、能进行分子改造并可反复变性、复性等优点,广泛应用于生物医学科学领域,如纯化,药物开发,疾病诊断和治疗等方面。乙肝表面抗原(HBsAg)是乙肝病毒(HBV)的外膜蛋白,它伴随乙肝病毒DNA的复制,并且在HBV感染者中出现最早、效价最高,是乙肝早期诊断的重要指标。临床上采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linke immunosorbent assay,ELISA)测定感染者血清中HBsAg的浓度,最低检测浓度为0.2ng/ml,但有的HBV感染者血中HBsAg的浓度很低,以致ELISA法可能检测不到,造成HBsAg检测结果假阴性。因此,精确测出HBsAg浓度对乙肝早期诊断至关重要。本实验目的是利用SELEX技术筛选获得HBsAg的特异性核酸适配体,进一步对其进行分子改造,在分子水平上建立一种基于HBsAg特异性核酸适配体的PCR检测方法,极大地提高HBsAg的检测灵敏度,解决临床通用检测方法的不足。具体研究方法如下：(1)优化ssDNA的制备方法,主要通过不对称PCR法、茎环引物法和长短链法进行探索；(2)通过HBV检测试剂盒对实验材料(HBsAg)进行活性测定；(3)建立硝酸纤维素滤膜-ELISA和树脂-ELISA两种方法,检测这两种载体与靶分子(HBsAg)的亲和性；(4)将这两种载体用于SELEX筛选,比较两者的筛选富集效果,并通过琼脂糖凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和荧光实时定量PCR方法对两种载体筛选的最终文库进行活性鉴定。通过以上研究,得出以下结果：1.利用三种不同的方法成功制备了ssDNA。其中不对称PCR法制备率较高,茎环引物法和长短链法能精确快速地确定出ssDNA的位置；长短链法中用荧光标记上游引物,能更准确地判断出ssDNA。通过对比得出长短链法制备ssDNA效果最佳,为进一步的SELEX筛选奠定基础；2.通过HBV检测试剂盒检测,结果显示实验材料为阳性；3.成功建立了两种载体-ELISA检测方法,并且检测出靶分子HBsAg能与硝酸纤维素滤膜和树脂载体结合,保证了后续SELEX筛选的准确性,也增强了筛选的目的性；4.通过PAGE、琼脂糖凝胶阻滞实验和荧光实时定量PCR检测,对比发现以树脂为载体的SELEX筛选富集效果较好。树脂背景吸附力弱,能牢固地固定HBsAg,增强了筛选的目的性,成功建立了优化SELEX筛选载体的方法。以树脂为载体,进行了13轮的SELEX筛选,阳性富集效果较好,为后续的转质粒研究及dot-blot实验奠定了基础。

全文目录

中文摘要  3-5
Abstract  5-10
第一章综述  10-21
  1.1 乙肝表面抗原(HBsAg)  10
  1.2 SELEX与核酸适配体  10-20
    1.2.1 SELEX技术的原理  11-12
    1.2.2 SELEX技术的完善  12-15
    1.2.3 核酸适配体及优越性  15-16
    1.2.4 载体-树脂  16
    1.2.5 核酸适配体的应用  16-20
  1.3 目的意义  20-21
第二章材料与方法  21-37
  2.1 材料与仪器  21-23
    2.1.1 主要试剂  21-22
    2.1.2 主要溶液  22-23
    2.1.3 仪器  23
  2.2 方法  23-37
    2.2.1 ssDNA制备方法的优化  23-29
    2.2.2 硝酸纤维素滤膜和树脂载体表面活性的测定  29-31
    2.2.3 硝酸纤维素滤膜和树脂为载体的SELEX筛选对比  31-33
    2.2.4 HBsAg-ssDNA的活性鉴定  33-37
第三章结果与讨论  37-55
  3.1 结果  37-52
    3.1.1 ssDNA制备方法的优化  37-39
    3.1.2 硝酸纤维素滤膜和树脂载体表面活性的测定  39-42
    3.1.3 硝酸纤维素滤膜和树脂为载体的SELEX筛选方法  42-49
    3.1.4 HBsAg-ssDNA的活性鉴定  49-52
  3.2 讨论  52-55
结论与展望  55-56
参考文献  56-62
在学期间的研究成果  62-63
致谢  63

HBsAg特异性核酸适配体的筛选

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