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抗绝经后骨质疏松蛋白疫苗的实验研究

作　者: 耿文鑫
导　师: 陈富林
学　校: 西北大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 骨质疏松 绝经后骨质疏松 卵泡刺激素 去势大鼠 蛋白疫苗
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 35次
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内容摘要


骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种以骨小梁减少、骨脆性增加为病理特征的代谢性骨病。在我国,约有2.1亿人骨量低于正常标准,至少有近7000万人患有骨质疏松症。其中绝经后骨质疏松症的发病率占据了骨质疏松总发病率的70%以上,由绝经后骨质疏松引发的骨脆性骨折,致残率和致死率均较高,严重威胁着中老年妇女的骨骼健康。因此,研制一种能够有效治疗绝经后骨质疏松的疫苗,能够显著提高中老年妇女生活质量、降低社会和家庭负担。长期以来,雌激素(estrogen)缺乏被认为是诱发绝经后骨质疏松的关键病因。激素替代疗法(hormone replacement therapy, HRT),尤其是雌激素替代疗法(estrogen replacement therapy, ERT)在临床上的广泛应用,也确实取得了一定的效果。有研究表明,雌激素能够通过下调IL-1、IL-6和TNF-α等炎症因子抑制破骨细胞分化,进而抑制骨吸收。但是,单纯的雌激素水平降低并不能充分解释性腺机能衰退导致的骨丢失。使用基因敲除鼠的研究发现,将雌激素受体a和β同时敲除的小鼠去势(ovariectomy, OVX),小鼠仅发生了轻微的骨质疏松,而单纯敲除雌激素α或β受体,小鼠则具有正常的骨量。这说明雌激素缺乏并非绝经后骨质疏松的单一诱因。研究发现,若在去势的同时摘除垂体(hypophysectomy),小鼠的骨量高于单纯去势的小鼠,这表明垂体分泌的激素在绝经后骨质疏松发生过程中发挥着非常关键的作用。垂体主要分泌卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone, LH)。在围绝经期早期,FSH水平就已经开始升高,并且FSH水平的升高与骨量的丢失相一致。但是,之前仅将FSH水平的升高作为绝经开始的标志之一,而未将其认为是骨质疏松的诱发因素。然而随着研究的深入,发现围绝经期存在FSH血浆水平异常升高、FSH血浆浓度与骨丢失密切相关等现象。并且最近的研究发现,FSH通过促进破骨细胞的形成,在骨质疏松发生中发挥着至关重要的作用。Mone ZaiDi等人发现破骨细胞的表面存在卵泡刺激素受体(follicle-stimulating hormone receptor, FSHR), FSH能够直接作用于破骨细胞表面的FSHR,激活MEK/Erk、NF-κB、Akt信号通路,促进破骨细胞的形成,进而促进骨吸收,调节骨量。这些研究结果均提示,FSH是诱发绝经后骨质疏松的关键病因。因此,我们认为阻断FSH与FSHR的结合,能够有效地治疗绝经后骨质疏松。方法基于Mone ZaiDi等人的研究结果,我们设计了针对FSH的绝经后骨质疏松蛋白疫苗,并进行了体外实验和体内实验：(1)检测外源性FSH对于破骨细胞分化和成骨细胞分化的影响。在破骨细胞诱导分化过程中和成骨细胞诱导分化过程中外源性加入FSH,检测其在不同浓度条件下对破骨细胞分化和成骨细胞分化的影响。(2)制备GST-hFSHβ重组蛋白。利用大肠杆菌对于密码子的偏爱性,优化人FSHp亚基(human FSH β subunit, hFSHβ)的成熟肽编码序列。通过化学合成的方法获得优化后的hFSHβ基因,并通过BamH I-EcoR I酶切位点克隆至pGEX-4T-1原核表达载体。IPTG诱导表达后,利用GSTrap亲和层析柱纯化GST-hFSHβ重组蛋白,并通过透析、冷冻干燥等方法,进行蛋白的除盐、浓缩和定量。(3)以GST-hFSHβ重组蛋白为抗原免疫OVX大鼠,以期治疗OVX大鼠的骨质疏松。将GST-hFSHβ重组蛋白与弗氏佐剂等体积混合后,皮下注射(subcutaneously, s.c.)免疫OVX大鼠,并通过Micro CT分析、三点弯曲实验、压力实验、组织形态学检测和血尿生化分析.ELISA检测等方法,评价以GST-hFSHβ重组蛋白为抗原免疫OVX大鼠对于OVX大鼠骨质疏松的治疗情况。结果通过体外和体内实验,我们获得了如下实验结果：(1)外源性FSH能够以剂量依赖方式促进破骨细胞分化,且该作用能够被抗hFSHβ抗血清阻断。在骨髓单核细胞向破骨细胞诱导分化过程中,外源性加入3ng/mL、10ng/mL和30ng/mL的FSH,发现外源性FSH对于细胞生长状态无明显影响的同时,破骨细胞分化的数量以及破骨细胞细胞核形成的数量对于FSH浓度均呈剂量依赖性升高,且在较低浓度(3ng/mL)时即可有明显的促进作用。在破骨细胞诱导分化过程中,加入抗hFSHβ抗血清,发现高浓度FSH (30ng/mL)对于破骨细胞分化的促进作用被阻断。(2)成功在大肠杆菌内表达GST-hFSHβ重组蛋白。通过删除hFSHβ信号肽序列、利用大肠杆菌偏爱密码子对hFSHβ成熟肽核酸序列进行优化以及对蛋白诱导表达条件(IPTG浓度、诱导时间、诱导温度、转速)进行优化等方法,提高蛋白表达量。以优化后的条件表达GST-hFSHβ重组蛋白,蛋白表达量可达到菌体总蛋白的31.4%。通过GSTrap亲和层析柱纯化、透析、冷冻干燥,获得了干燥的GST-hFSHβ重组蛋白。(3)以GST-hFSHβ重组蛋白为抗原免疫OVX大鼠,成功治疗了OVX大鼠的骨质疏松。末次免疫后第10天,OVX大鼠血清的抗体效价为1：128万,说明我们以GST-hFSHβ重组蛋白为抗原免疫OVX大鼠,成功诱导大鼠产生了针对FSH的多克隆抗体,并且获得了较高的抗体效价。骨密度(bone mineral density, BMD)检测结果显示治疗组大鼠的BMD得到了显著改善,6月时可达到Sham组的90%,12月时约为Sham组的85%,并且均显著高于OVX组(P<0.01)。Micro CT分析结果表明,GST-hFSHβ重组蛋白免疫治疗后,OVX大鼠股骨的Bone Volume/Total Volume (BV/TV), Trabecular Thickness (Tb.Th)和Trabecular Number (Tb.N)均显著高于OVX组,而Bone Surface Area/Bone Volume (BSA/BV), Trabecular Spacing (Tb.Sp)和Trabecular Pattern Factor(TPF)均显著低于OVX组,说明在体免疫治疗后,OVX大鼠的骨小梁丢失得到了明显缓解,骨量显著提高。三点弯曲(three-point bending test)和压力实验(compression test)实验结果表明,免疫治疗后,OVX大鼠皮质骨和松质骨的力学性质得到了显著提高,并且该结果支持BMD检测和Micro CT分析的结果。组织形态学检测的结果也证实了力学检测、BMD检测和Micro CT分析的实验结果,均显示治疗后OVX大鼠的骨小梁参数得到了显著改善,并且抗酒石酸盐酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)染色结果表明,GST-hFSHβ重组蛋白免疫治疗后,OVX大鼠股骨生长板附近的破骨细胞数量显著下降。生化分析以及ELISA检测表明,治疗组OVX大鼠的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨钙素(osteocalcin, OC)、尿钙(calcium, Ca)、尿磷(phosphorus, P)和尿脱氧吡啶酚(deoxypyridinoline, DPD)等绝经后骨质疏松相关参数的升高均得到了显著抑制。结论使用基于FSHp的蛋白疫苗免疫OVX大鼠,能够显著缓解大鼠OVX诱发的骨质疏松,证实FSH信号转导通路在性腺机能衰退导致的骨丢失中发挥重要作用,为使用基于FSH的抗绝经后骨质疏松蛋白疫苗治疗人绝经后骨质疏松提供了动物实验依据。

全文目录


摘要  3-7
Abstract  7-16
第一章 绪论  16-26
  1.1 骨骼的结构  16
  1.2 骨质疏松概念  16
  1.3 骨质疏松发病现状  16-17
  1.4 人口老龄化加剧骨质疏松发病率  17
  1.5 骨质疏松危害  17-18
  1.6 骨质疏松临床表现  18
  1.7 骨质疏松临床诊断标准  18-19
  1.8 骨质疏松临床参考指标  19
  1.9 目前的治疗方法  19-20
  1.10 骨质疏松发病机理  20-21
  1.11 绝经后骨质疏松机制研究中的新发现  21-23
  1.12 本论文研究的主要内容及意义  23-26
第二章 构建pGEX-4T-1-hFSHβ原核表达载体  26-41
  2.1 引言  26-27
  2.2 试剂与仪器  27-29
    2.2.1 主要试剂  27-28
    2.2.2 主要仪器  28-29
  2.3 方法  29-36
    2.3.1 主要溶液配制方法  29-30
    2.3.2 分子生物学常用方法  30-34
    2.3.3 hFSHβ基因合成  34
    2.3.4 构建pGEX-4T-1-hFSHβ表达载体  34-36
    2.3.5 pGEX-4T-1-hFSHβ表达载体的鉴定  36
    2.3.6 pGEX-4T-1-hFSHβ表达载体的保存  36
  2.4 结果  36-39
    2.4.1 hFSHβ成熟肽基因序列偏爱密码子优化  36-37
    2.4.2 pGEX-4T-1-hFSHβ酶切鉴定结果  37-38
    2.4.3 pGEX-4T-1-hFSHβ测序鉴定  38-39
  2.5 讨论  39-40
    2.5.1 表达系统的选择  39
    2.5.2 表达载体的选择  39-40
  2.6 本章小结  40-41
第三章 GST-hFSHβ重组蛋白表达及纯化  41-57
  3.1 引言  41
  3.2 试剂与仪器  41-43
    3.2.1 主要试剂  41-43
    3.2.2 主要仪器设备  43
  3.3 方法  43-51
    3.3.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳  43-47
    3.3.2 蛋白的诱导表达  47
    3.3.3 诱导表达条件的优化  47
    3.3.4 可溶性鉴定  47-48
    3.3.5 包涵体溶解  48-49
    3.3.6 蛋白纯化系统的蛋白纯化  49-50
    3.3.7 透析  50
    3.3.8 冷冻干燥  50-51
  3.4 结果  51-53
    3.4.1 蛋白诱导表达  51-52
    3.4.2 蛋白纯化  52
    3.4.3 蛋白冷冻干燥  52-53
  3.5 讨论  53-56
    3.5.1 选择FSHβ成熟肽原因  53
    3.5.2 蛋白高表达原因  53-55
    3.5.3 表达菌株的选择  55-56
    3.5.4 蛋白纯化方法的选择  56
    3.5.5 蛋白浓缩和定量方法的选择  56
  3.6 本章小结  56-57
第四章 外源性FSH促进破骨细胞分化的实验研究  57-74
  4.1 引言  57
  4.2 试剂耗材与仪器  57-59
    4.2.1 主要试剂耗材  57-58
    4.2.2 主要仪器  58-59
  4.3 方法  59-65
    4.3.1 主要溶液配方  59-60
    4.3.2 骨髓单核细胞向破骨细胞的诱导分化  60-61
    4.3.3 破骨细胞的TRAP染色  61-62
    4.3.4 FSH对于破骨细胞诱导分化的影响  62
    4.3.5 抗血清对于FSH促破骨细胞分化的影响  62
    4.3.6 全骨髓向成骨细胞的诱导分化  62-63
    4.3.7 FSH对于成骨细胞诱导分化的影响  63
    4.3.8 Gomori改良钙钴法  63-64
    4.3.9 Von Kossa染色  64-65
    4.3.10 统计  65
  4.4 结果  65-72
    4.4.1 外源性FSH能够以剂量依赖方式促进破骨细胞分化  65-68
    4.4.2 抗hFSHβ抗血清能够阻断外源性FSH对破骨细胞分化的促进作用  68-69
    4.4.3 高浓度外源性FSH能够促进成骨细胞分化  69-72
  4.5 讨论  72-73
    4.5.1 破骨细胞诱导方法的选择  72
    4.5.2 FSH对于骨细胞分化的影响  72-73
  4.6 本章小结  73-74
第五章 以GST-hFSHβ为抗原在体免疫治疗OVX大鼠的骨质疏松  74-106
  5.1 引言  74-75
  5.2 试剂和仪器  75-77
    5.2.1 主要试剂  75-76
    5.2.2 主要仪器  76-77
  5.3 方法  77-89
    5.3.1 骨质疏松大鼠动物模型的建立方法  77
    5.3.2 免疫动物方法  77-78
    5.3.3 动物分组及饲养  78
    5.3.4 血尿样品收集  78-79
    5.3.5 骨样品收集  79
    5.3.6 测抗体效价  79
    5.3.7 血尿检测  79-80
    5.3.8 Micro CT分析  80
    5.3.9 BMD检测  80-81
    5.3.10 生物力学检测  81-82
    5.3.11 组织学检测  82-89
    5.3.12 统计部分  89
  5.4 结果  89-103
    5.4.1 体重变化  89-90
    5.4.2 抗体效价  90
    5.4.3 BMD  90
    5.4.4 血尿检测  90-93
    5.4.5 Micro CT结果  93-96
    5.4.6 生物力学检测结果  96-100
    5.4.7 组织学  100-103
  5.5 讨论  103-105
    5.5.1 GST标签对于hFSHβ重组蛋白免疫结果的影响  103
    5.5.2 FSH信号通路与成脂诱导  103
    5.5.3 抗体效价  103
    5.5.4 血尿结果分析  103-104
    5.5.5 力学检测结果分析  104
    5.5.6 骨质疏松治疗效果减弱分析  104-105
  5.6 本章小结  105-106
结论  106-107
参考文献  107-123
缩略词  123-125
攻读博士学位期间取得的科研成果  125-127
致谢  127-128
作者简介  128

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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