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卡介苗胞壁糖脂组分的分离纯化及免疫活性研究

作　者: 李瑞营
导　师: 祝秉东
学　校: 兰州大学
专　业: 遗传学
关键词: 结核病卡介苗糖脂细胞壁佐剂
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：为了研究结核分枝杆菌糖脂组分的免疫活性,本实验以卡介苗(Bacille Calmette Guerin, BCG)为原料,分离其糖脂组分,从糖脂的免疫原性和佐剂效应方面研究BCG胞壁糖脂类组分的免疫活性。抗原活性包括细胞免疫和体液免疫；佐剂效应,则是与现有的佐剂阳离子脂质体DDA混合,分析BCG胞壁糖脂是否能够作为佐剂辅助提高蛋白疫苗的免疫效应。方法：首先以批量扩增的BCG为原料,用氯仿：甲醇(2：1)反复萃取获得总糖脂,再采用TLC,硅胶柱层析方法得到糖脂组分Ga, Gb,将Ga和Gb分别与阳离子脂质体DDA混合作为结核分枝杆菌抗原Ag85B的佐剂疫苗免疫C57BL／6小鼠,免疫五周后检测脾脏淋巴细胞抗原特异性IFN-γ的分泌水平及抗体水平来分析两种糖脂组分的的佐剂效应。以上述方法获得的总脂为基础,采用硅胶柱层析,凝胶柱层析以及薄层层析相结合的分离纯化条件得到八种糖脂组分,通过刺激BCG免疫C57BL／6小鼠脾脏淋巴细胞,ELISPOT检测IFN-γ分泌水平的方法来分析八种糖脂组分的细胞免疫原性,并用改良的ELISA方法检测这些小鼠中分别抗八种糖脂抗原的IgG抗体水平。除此之外,我们还检测了这八种糖脂组分在结核感染病人及健康对照中的特异性IgG抗体水平,分析其在结核病人中的体液免疫反应。我们进一步研究BCG胞壁糖脂组分的化学结构特性。挑选糖脂Ga重点解析其结构特点,采用高分辨质谱,红外质谱,核磁共振光谱方法简单分析两种糖脂的结构,并根据已报道文献来判断其所述类别。结果：我们发现在DDA的基础上加入糖脂Ga后,脾脏分泌IFN-γ的水平降低(P=0.071),血清中IgG1的水平降低而抗体IgG2b的水平则相反；DDA+Gb佐剂组的IFN-γ的分泌水平高于BCG组(P=0.054)。其次从BCG表面分离得到的糖脂组分G1, G2, G4, G7, G8刺激BCG免疫小鼠脾脏淋巴细胞产生IFN-γ,且刺激产生IFN-γ分泌的能力与结核分枝杆菌抗原Ag85B相近。最后我们发现结核感染人群针对糖脂G2,G3的IgG水平最高(P<0.05),且明显高于健康人群(P<0.001)。我们根据文献报道以及各谱图综合解析推断Ga是一种链状脂肪族酯类化合物。结论：本实验所分离得到的BCG胞壁糖脂组分均具有免疫活性,Ga, Gb具有免疫调节功能。G2,G3在结核病人和健康对照人群中的IgG抗体水平差异显著,有望成为活动性结核诊断的生物标记。

全文目录

中文摘要  3-5
Abstract  5-7
英文缩略词表  7-10
前言  10-13
1 实验材料  13-15
  1.1 实验动物  13
  1.2 主要材料  13
  1.3 主要仪器  13-15
2 实验方法  15-30
  2.1 结核分枝杆菌抗原Ag85B的制备  15-18
    2.1.1 抗原Ag85B蛋白的表达  15
    2.1.2 纯化步骤  15-16
    2.1.3 SDS-PAGE蛋白电泳的配置及条件  16-17
    2.1.4 蛋白浓度测定  17-18
  2.2 BCG胞壁糖脂组分分离  18-21
    2.2.1 相关培养基及试剂的配置  18-19
    2.2.2 BCG增菌及总脂萃取  19-20
    2.2.3 糖脂组分分离纯化方法一  20
    2.2.4 糖脂组分分离纯化方法二  20-21
  2.3 糖脂组分活性检测  21-29
    2.3.1 ELISPOT方法检测八种糖脂的细胞免疫活性  21-23
    2.3.2 体液免疫活性检测  23-25
    2.3.3 疫苗佐剂活性检测  25-29
  2.4 糖脂Ga的结构分析  29-30
3 实验结果  30-42
  3.1 Ag85B表达纯化结果  30
  3.2 糖脂分离方法一所获组分活性及结构分析  30-36
    3.2.1 总脂萃取结果  30-31
    3.2.2 糖脂Ga,Gb的分离纯化结果  31-32
    3.2.3 糖脂Ga,Gb的佐剂效应  32-34
    3.2.4 糖脂Ga的结构分析  34-36
  3.3 糖脂分离方法二所获组分活性分析  36-42
    3.3.1 八种糖脂组分的分离纯化结果  36-37
    3.3.2 八种糖脂抗原刺激BCG初免小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌水平  37-39
    3.3.3 不同人群针对八种糖脂抗原的特异性IgG抗体水平  39-42
4 讨论  42-45
5 结论  45-46
6 综述  46-50
7 参考文献  50-57
8 研究成果  57-58
9 致谢  58

卡介苗胞壁糖脂组分的分离纯化及免疫活性研究

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