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鹦鹉热嗜衣原体Ⅲ型分泌系统效应蛋白的预测、鉴定及特性的研究

作　者: 伍海英
导　师: 吴移谋
学　校: 南华大学
专　业: 病原生物学
关键词: 生物信息学 鹦鹉热嗜衣原体 Ⅲ型分泌系统 效应蛋白 包涵体膜蛋白 时相表达 特异性
分类号: R374.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：预测、筛选鹦鹉热嗜衣原体（Chlamydophila psittaci, Cps）III型分泌系统（Type III secretion system, T3SS）效应蛋白，研究其细胞内定位和特征。方法：计算机辅助的生物信息学方法Effective T3、BPBAac tool，以及其他T3SS效应蛋白文献资料，预测Cps T3SS效应蛋白编码基因。提取Cps6BC菌株DNA为模板，设计特异性引物，PCR扩增Cps T3SS假设效应蛋白编码基因，酶切后连接到载体pGEX-6P-1上，亚克隆构建重组质粒pGEX-6P-1/目的片段，经PCR、测序鉴定后转化至表达宿主菌E.coli BL21中，并进行IPTG诱导表达。对温度、IPTG浓度和时间等诱导表达条件进行系列优化后获得可溶性表达蛋白，并大量诱导表达，Western blot分析和鉴定表达产物。GST树脂纯化重组蛋白，BCA法测定蛋白浓度；重组蛋白皮下免疫BALB/c小鼠，检测免疫小鼠血清中重组蛋白多克隆抗体的效价，并以制备的多克隆抗体为一抗，应用间接免疫荧光（Immunofluorescence assay, IFA）检测假设效应蛋白在感染细胞的定位情况，以筛选Cps效应蛋白。对筛选出来的效应蛋白，监测其在不同时间点的分泌情况，并用RT-PCR和Western blot分析其转录和蛋白表达时相。此外，Western blot分析效应蛋白与其他衣原体的血清的交叉反应。ELISA法检测效应蛋白刺激THP-1细胞产生IL-1β、IL-6和TNF-α的情况。结果：应用Effective T3、BPBAac tool交叉验证，预测了9个Cps T3SS效应蛋白编码基因：CPSIT0357、CPSIT0429、CPSIT0461、CPSIT0463、CPSIT0490、CPSIT0594、CPSIT0785、CPSIT0844、CPSIT0846，并结合相关文献，选取了CPSIT0019、CPSIT0020、CPSIT0968、CPSIT0969、CPSIT0942。培养Cps6BC48h后提取DNA，扩增得到其目的片段；构建的重组质粒经PCR和测序证实插入片段为目的基因，测序结果与Genbank上登录序列完全一致；SDS-PAGE结果显示，在IPTG诱导下，对诱导表达条件进行系列的优化后，除CPSIT0357、 CPSIT0429、CPSIT0968、CPSIT0969外，重组菌分别表达了相对分子量（Mr）与预测分子量相近的可溶性蛋白。经GST树脂纯化后，将重组蛋白免疫雌性BALB/c小鼠，收集血清，检测其抗体效价：CPSIT0785、CPSIT0844、CPSIT0846、CPSIT0019、CPSIT0020效价高达1:64000。IFA细胞内定位观察中，CPSIT0844和CPSIT0846位于包涵体膜，而CPSIT0461、CPSIT0463、CPSIT0490、CPSIT0594、CPSIT0785、CPSIT0019、CPSIT0020、CPSIT0942位于包涵体内。CPSIT0844、CPSIT0846在Cps感染后0、6、12、18、24h后进行IFA监测，18h能观察到分泌于包涵体膜，并在随后的整个感染周期中位于包涵体膜。感染后2h即可在RT-PCR中检测到CPSIT0846的mRNA的转录，而CPSIT0844在12h检测到其转录，Western blot也显示了相同的结果，并随感染的时间而递增。CPSIT0844、CPSIT0846与Cps抗血清在相应条带有反应，而与肺炎嗜衣原体（Chlamydia pneumoniae，Cpn）和沙眼衣原体（Chlamydiatrachomati， Ct）抗血清无交叉反应。CPSIT0844、CPSIT0846能诱导THP-1细胞表达IL-1β、IL-6和TNF-α。结论：1. Effective T3、BPBAac tool信息学筛选T3SS效应蛋白，结合显微镜定位分析，对T3SS的研究具有指导性意义。2. CPSIT0844、CPSIT0846位于包涵体膜，而CPSIT0461、CPSIT0463、CPSIT0490、CPSIT0594、CPSIT0785、CPSIT0019、CPSIT0020、CPSIT0942主要位于包涵体内。3. CPSIT0844、CPSIT0846作为效应蛋白，在感染中期和早期发挥了一定的作用，体外能诱导THP-1细胞产生炎症因子。CPSIT0844、CPSIT0846与Cps抗血清有良好反应，而与Cpn、Ct抗血清无交叉反应。

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