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泛素C末端水解酶UCH-L1在SAMP8小鼠海马CA1区的增龄变化及意义

作　者: 潘莹
导　师: 崔慧先; 康林
学　校: 河北医科大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: UCH-L1 AD SAMP8 增龄变化树突棘
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：泛素C末端水解酶（UCH-L1），是维持正常突触和认知功能所必须的。本研究以SAMP8小鼠为实验对象，运用免疫组织化学，PCR和WesternBlot等技术，在mRNA和蛋白水平研究UCH-L1在海马CA1区的增龄变化，初步探讨UCH-L1、UPP途径在快速老化过程及神经退行性病变中的作用，充实脑老化及学习记忆的神经机制。方法：1动物及分组：选用3、6、9、12月龄SAMR1，SAMP8小鼠各10只。2组织制备及染色观察：每组取3只小鼠，将小鼠麻醉并暴露心脏，随后将输液针刺入左心室，同时用剪刀挑开右心耳，迅速用生理盐水冲洗，至无血后，用4%多聚甲醛进行灌注。取自上丘至视交叉节段的脑组织，从正中矢状位分为左右两半后，常规制备成石蜡切片，以备抗UCH-L1免疫组化染色，分析各组小鼠海马的CA1区光密度；另一半用于Gogli染色，并计数各组小鼠海马CA1区第2～3级顶树突树突棘密度。3蛋白提取及SAM系小鼠各器官活性去泛素化酶检测，取6月龄SAMP8小鼠一只，6％的水合氯醛麻醉后，迅速取心脏，肝脏，睾丸，海马，额叶皮质。PBS清洗后，迅速置于裂解液中，充分匀浆后冰上静置30min后12000rpm4℃离心20分钟，弃沉淀，取上清液，小部分上清液用于蛋白质浓度的测定（考马斯亮蓝法测定），其余部分与HA标记活性去泛素化酶探针结合1小时，进行Western Blot检测各器官上活性去泛素化酶的分布。4mRNA提取及PCR：每组取3只小鼠，6％水合氯醛麻醉后，在冰上迅速断头，去除顶骨，暴露脑组织，PBS清洗后，分离出海马置于PBS中，迅速转移至Trizol中，常规提取mRNA，用NanoDrop2000C进行定量，反转录成cDNA，-20℃保存，用于PCR检测。5蛋白提取及Western Blot：每组取3只小鼠，6％水合氯醛麻醉后，在冰上迅速断头，去除顶骨，暴露脑组织，PBS清洗后，分离出海马置于PBS中，迅速转移置裂解液中，充分匀浆后于冰上静置30min，12000rpm4℃离心20min，取上清液，弃沉淀，小部分上清液用考马斯亮蓝法测定法进行蛋白质浓度的测定，其余部分上清液置于-80℃冰箱储存，用于Western Blot检测。结果:1SAM系小鼠各器官活性去泛素化酶检测：活性去泛素化酶在SAM系小鼠的各器官均有表达，在海马中，36kD处有明显条带，提示UCH-L1在海马上有大量活性表达。2UCH-L1mRNA PCR表达情况：6月R1组表达量大于其他各组，12月P8组小于其它各组；R1组各月龄表达水平为0.345±0.013，0.770±0.032，0.553±0.020，0.385±0.014，大于其它同月龄SAMP8鼠，分别为0.344±0.014，0.658±0.040，0.388±0.015，0.292±0.017(P<0.05)。3Western Blot结果：6月SAMR1组海马组织中UCH-L1表达丰富，其IOD值为2.224±0.028，明显高于其他各组（P<0.05）；12月SAMP8组海马组织中有少量的UCH-L1表达，其IOD值为0.933±0.044，明显低于其他组（P<0.05）。9月SAMR1组的IOD值为1.486±0.032较9月SAMP8组1.085±0.025高（P<0.05）；3月SAMR1组和3月SAMP8组IOD值分别为1.280±0.030和1.235±0.012，两组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。4抗UCH-L1免疫组化结果：6月SAMR1组海马CA1区染色深，其光密度值为0.384±0.016，明显高于其他各组（P<0.05）；12月SAMP8组海马CA1区染色浅，其光密度值为0.172±0.002，明显低于其他各组（P<0.05）。9月SAMR1组光密度值为0.267±0.011较9月SAMP8组（0.232±0.012）高（P<0.05）；12月SAMR1组光密度值为0.234±0.010较12月SAMP8组高（P<0.05）。3月SAMR1组海马CA1区（0.251±0.006）光密度值与3月SAMP8组海马CA1区（0.249±0.011）相比较，差异无统计学意义（P>0.05）。5Gogli染色结果：6月SAMR1组海马CA1区树突棘排列密集，树突棘数目为1.417±0.064/μm2，明显高于其它各组（P<0.05）；12月SAMP8组树突棘数目为0.900±0.029/μm2，明显低于其它各组（P<0.05）；9月SAMR1组树突棘密度为1.152±0.054/μm2较9月SAMP8组高（P<0.05）；12月SAMR1组树突棘密度为1.006±0.061/μm2较12月SAMP8组高（P<0.05）。3月SAMR1组树突棘密度（1.144±0.042/μm2）与3月SAMP8组树突棘密度（1.151±0.050/μm2）相比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：1活性去泛素化酶在SAM系小鼠的各器官中均有表达，UCH-L1在神经系统中表达量大。2在基因水平和蛋白水平上，6、9、12不同的月龄，SAMR1小鼠UCH-L1表达量高于同月龄的SAMP8小鼠。3月龄组表达量无差异。3在基因水平和蛋白水平上，SAMR1小鼠和SAMP8小鼠的UCH-L1含量随月龄的增加而减少。4在6，9，12不同的月龄，SAMR1小鼠树突棘的数量要多余同月龄的SAMP8小鼠。3月龄组表达量无差异。5在不同的月龄中，SAMR1小鼠和SAMP8小鼠的树突棘的数量随月龄的增加而减少。

泛素C末端水解酶UCH-L1在SAMP8小鼠海马CA1区的增龄变化及意义

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