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内毒素结合肽突变体（mEBP9）的聚乙二醇定点修饰及其稳定性和拮抗内毒素效应研究

作　者: 徐小明
导　师: 刘友生
学　校: 第三军医大学
专　业: 病理学
关键词: 内毒素 mEBP9 PEG-NH-mEBP9 EBP 拮抗内毒素 生物活性
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


革兰氏阴性杆菌外膜的主要成分内毒素(lipopolysaccharide, LPS)是临床上导致全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)和脓毒症(sepsis)的主要原因。目前SIRS或者脓毒症仍然具有较高的发病率和死亡率，现阶段防治革兰氏阴性杆菌引起的SIRS或者脓毒症主要依赖于抗生素控制感染，但对内毒素血症(Endotoxemia)的疗效并不理想。脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)具有放大LPS毒性的作用。LBP的氨基端含有特异性LPS结合位点；LBP的第91-108位氨基酸序列是已知的结合LPS能力很强的氨基酸序列(Endotoxin binding peptide，EBP)。在本课题组前期工作中，为增强EBP的拮抗LPS生物活性，通过对EBP的结构进行改建，从11条内毒素结合肽突变体(mutant of EBP，mEBP)中筛选出拮抗LPS作用较强的第9条内毒素结合肽突变体(mEBP9)。鉴于普通多肽在体内容易被降解，生物半衰期较短，而经聚乙二醇修饰的多肽在体内比未经修饰的多肽可能具有较高的稳定性和较好的保护效应；本研究在mEBP9的氨基端或者羧基端引入一个半胱氨酸(mEBP9-SH)，通过mEBP9-SH上的巯基加成到mPEG-MAL(甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺)的双键上，实现对mEBP9进行聚乙二醇定点修饰。我们课题组通过生物合成途径已经获得mEBP9、 PEG-NH-mEBP9以及PEG-COOH-mEBP9，观察PEG-NH-mEBP9和PEG-COOH-mEBP9的拮抗LPS活性并筛选出拮抗LPS效应更强的PEG-NH-mEBP9；在此基础上比较PEG-NH-mEBP9与mEBP9的体内外拮抗LPS活性。主要研究结果如下：1. CCK-8法检测结果显示1、5、10、20μmol/L的mEBP9、PEG-NH-mEBP9和PEG-COOH-mEBP9对RAW264.7细胞均无可见的细胞毒性。2. PEG-NH-mEBP9抑制LPS诱导的TAL活化效应明显强于同浓度的PEG-COOH-mEBP9(P＜0.01)；PEG-NH-mEBP9抑制LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6作用优于等浓度的PEG-COOH-mEBP9。3.10μmol/L的PEG-NH-mEBP9或mEBP9在-20℃放置30天后抑制LPS诱导的TAL活化能力大于在37℃放置30天后的PEG-NH-mEBP9或mEBP9；10μmol/L的mEBP9在-20℃环境放置30天后抑制LPS诱导的TAL活化能力大于等浓度的PEG-NH-mEBP9；10μmol/L的PEG-NH-mEBP9在37℃环境放置30天后抑制LPS诱导的TAL活化作用明显强于同浓度的mEBP9(P＜0.05)。LPS诱导RAW264.7细胞3h、6h、12h后，5μmol/L的mEBP9抑制RAW264.7细胞分泌TNF-α效应均强于同一时相点同浓度的PEG-NH-mEBP9；LPS刺激RAW264.7细胞24h、36h、48h后，5μmol/L的PEG-NH-mEBP9的抑制RAW264.7细胞分泌TNF-α能力反而都强于同一时相点等浓度的mEBP9。4. PEG-NH-mEBP9与mEBP9体外拮抗LPS生物活性比较：mEBP9抑制LPS诱导的TAL活化效应强于同浓度的PEG-NH-mEBP9；mEBP9抑制LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6作用明显优于等浓度的PEG-NH-mEBP9(P＜0.05)。5. PEG-NH-mEBP9和mEBP9体内拮抗LPS效应比较：(1)提高模型小鼠生存率：“LPS/D-GalN”组48h内全部死亡，“mEBP9+LPS/D-GalN”组和“PEG-NH-mEBP9+LPS/D-GalN”组48h生存率分别为为40%和60%。(2)减少血浆TNF-α和IL-6水平：LPS/D-GalN处理后90min，PEG-NH-mEBP9和mEBP9都可以明显抑制小鼠体内血浆TNF-α/IL-6分泌(P＜0.01)，且PEG-NH-mEBP9拮抗LPS的效应显著强于mEBP9(P＜0.05)。(3)减少血清ALT和AST水平：LPS/D-GalN处理后6h，PEG-NH-mEBP9和mEBP9都可以明显抑制小鼠体内血清ALT/AST活性(P＜0.01)，且PEG-NH-mEBP9拮抗LPS活性明显强于mEBP9(P＜0.05)。(4)减轻小鼠肝脏病理组织学改变：“LPS/D-GalN”组肝脏有明显的病理学改变，包括肝细胞坏死，充血，肝组织结构的破坏，肝窦内大量的炎症细胞聚集；“LPS/D-GalN+mEBP9”组肝脏组织坏死的区域和坏死程度均降低，而且炎症细胞浸润减少；“LPS/D-GalN+PEG-NH-mEBP9”组肝脏病理组织学改变程度比“LPS/D-GalN+mEBP9”组轻。主要研究结论：PEG-NH-mEBP9拮抗LPS效应优于PEG-COOH-mEBP9；PEG-NH-mEBP9拮抗LPS的生物活性稍逊于mEBP9，而PEG-NH-mEBP9的体外稳定性优于mEBP9；PEG-NH-mEBP9和mEBP9均可保护D-氨基半乳糖增敏的内毒素血症模型小鼠，且PEG-NH-mEBP9对模型小鼠的保护作用优于mEBP9。

全文目录


英文缩写一览表  4-6
英文摘要  6-9
中文摘要  9-11
前言  11-14
第一部分 聚乙二醇定点修饰的mEBP9 的构建、筛选及其稳定性实验  14-37
  实验材料  14-15
  实验方法  15-23
  实验结果  23-35
  讨论  35-37
第二部分 PEG-NH-mEBP9 拮抗内毒素效应实验  37-57
  实验一 PEG-NH-mEBP9 体外拮抗内毒素活性实验  37-46
    实验材料  37-38
    实验方法  38-42
    实验结果  42-46
  实验二 PEG-NH-mEBP9 体内拮抗内毒素活性实验  46-55
    实验材料  46-47
    实验方法  47-50
    实验结果  50-55
  讨论  55-57
全文总结  57-58
致谢  58-59
参考文献  59-62
文献综述 内毒素拮抗措施研究进展  62-73
  参考文献  69-73
攻读硕士学位期间发表的文章  73

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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