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MAVS通过TRAF3调控ASC介导的炎症信号通路的研究

作　者: 宋婷
导　师: 马清钧; 钟辉
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 遗传学
关键词: MAVS TRAF3 ASC 炎症小体 泛素化
分类号: R363
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


先天性免疫系统是机体识别和清除入侵病原体的第一道防线，具有作用广泛、启动迅速的特点，在保护机体、抵抗感染的过程中具有极其重要的作用。先天性免疫应答的激活主要通过宿主的模式识别受体(PRRs)识别病原微生物的病原相关分子模式(PAMPs)，进而招募相应的接头蛋白，激活信号级联反应，诱导I型干扰素、促炎细胞因子、趋化因子的分泌和表达，从而杀伤和清除病原微生物。针对不同的病原相关分子模式，机体有不同的模式识别受体应答。目前发现的模式识别受体包括三种：TLRs、RLRs和NLRs。它们可以通过激活NF-B和IRF等转录因子促进I型干扰素等基因的转录，也可以通过起始胞浆内炎症小体复合物(inflammsome)的组装促进促炎细胞因子的成熟与释放。炎症小体由受体蛋白，接头蛋白ASC和效应分子pro-caspase-1构成。宿主炎症小体的功能状态与病原微生物的致病性密切相关，一方面炎症小体的适度激活具有杀灭病原体以及抑制感染的作用；另一方面，过度的炎症反应会导致多种组织和器官伤害，甚至危及生命。因此，炎症小体需要精准的调控，鉴定和筛选新的炎症小体调控分子对于抵抗病原微生物感染具有十分重要的意义。凋亡相关点状蛋白ASC作为炎症小体信号通路中关键的接头蛋白，在信号传递过程中必不可少。它通过PYRIN和CARD结构域连接受体蛋白和pro-caspase-1，使pro-caspase-1切割为有活性的caspase-1，最终促进IL-1和IL-18等成熟和分泌。鉴于ASC在炎症小体介导的细胞因子成熟过程中的重要作用，我们将其作为靶点筛选参与炎症小体激活的新调控分子，通过酵母双杂交实验发现线粒体抗病毒信号蛋白MAVS有可能和ASC相互作用，进一步研究表明：1. MAVS与ASC发生相互作用：通过免疫共沉淀、GST-pulldown、线粒体分离、免疫荧光、免疫印迹等方法，发现MAVS与ASC在体内外形成复合物；通过构建截短突变体等方法，发现MAVS通过CARD和TM结构域与ASC的CARD结构域相互作用。2. MAVS通过上调ASC的蛋白稳定性促进其介导的IL-1产生：ELISA结果表明，MAVS能促进ASC介导的IL-1产生，该现象依赖于MAVS的CARD结构域、TM结构域及其二聚化；免疫印迹结果表明，过表达的MAVS能上调ASC的蛋白水平，敲低细胞内源MAVS的表达导致ASC的蛋白水平降低；RT-PCR结果表明，MAVS不影响ASC的mRNA水平。3. MAVS通过E3泛素连接酶TRAF3调控ASC：通过筛选6种与MAVS密切相关的E3泛素连接酶，发现TRAF3可以增强ASC的蛋白稳定性及其介导的IL-1水平；进一步研究表明，TRAF3能与ASC相互作用并使其泛素化，而丧失了E3连接酶功能的TRAF3(C53AC56A)和TRAF3(C68AH70A)突变体不能泛素化ASC；在TRAF3knockdown细胞中，MAVS不能明显上调ASC的蛋白稳定性。4. TRAF3催化ASC K174位发生K63-连接的泛素化：通过构建一系列Ub的KR突变体，发现TRAF3催化ASC发生K63-连接的泛素化；通过构建一系列ASC的KR突变体，发现ASC第174位赖氨酸是可能的泛素化位点；与野生型ASC相比，ASC(K174R)突变体的蛋白稳定性及其介导的IL-1水平均不受MAVS与TRAF3的影响。5.病毒感染后ASC的核质穿梭依赖于TRAF3对其泛素化修饰：VSV感染后，ASC出现明显的泛素化修饰与核质穿梭；与野生型细胞相比，在MAVS与TRAF3knockdown细胞中，病毒感染引起的ASC的泛素化修饰水平降低，核质穿梭现象减弱。核质分离和免疫荧光实验表明，病毒感染后，TRAF3促进野生型ASC由细胞核向细胞质转移，而对ASC(K174R)突变体的细胞定位无明显影响。6.病毒感染后MAVS与TRAF3促进炎症小体的激活：与野生型MEF细胞相比，在MAVS-/-与TRAF3-/-细胞中，SeV感染诱导的pro-caspase-1的切割减弱、IL-1水平下降；用VSV分别感染野生型与MAVS-/-小鼠的BMDC细胞后，MAVS-/-细胞中pro-caspase-1的切割程度与caspase-1的酶活性均低于野生型细胞。综上所述，本研究发现MAVS通过E3泛素连接酶TRAF3，上调ASC的蛋白稳定性，促进其介导的IL-1产生。TRAF3催化ASC发生K63-连接的泛素化修饰，修饰的可能位点为ASC第174位赖氨酸。进一步研究表明，ASC的泛素化能介导病毒感染诱导的核质穿梭，在此基础上促进炎症小体的激活。本研究不但鉴定了新的炎症小体调控因子，阐明了MAVS与TRAF3调控炎症小体的分子机制，同时也为揭示不同信号转导途径之间的交联机制提供了重要的理论依据。

全文目录


缩略词表  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
前言  11-27
  1. RLRs 介导的 I 型干扰素抗病毒信号通路  11-17
    1.1 RIG-I 样受体(RLRs)  12
    1.2 MAVS 是 RLR 通路中关键的接头蛋白  12-17
  2. NLRs 介导的炎症小体信号通路  17-25
    2.1 炎症小体简介  17-19
    2.2 ASC 是炎症小体信号通路中重要的接头蛋白  19-22
    2.3 炎症小体的激活  22-25
    2.4 炎症小体与疾病  25
  3. 本课题研究的科学问题  25-27
材料与方法  27-37
  1. 材料  27-28
    1.1 细胞株  27
    1.2 菌株与质粒  27
    1.3 常用试剂盒  27
    1.4 分子生物学及细胞生物学试剂  27
    1.5 抗体  27-28
    1.6 其它化学试剂  28
    1.7 主要实验仪器  28
  2. 实验方法  28-37
    2.1 细胞总 RNA 的提取  28-29
    2.2 反转录 PCR  29
    2.3 载体构建、引物合成及测序  29
    2.4 细胞培养、冻存和复苏  29-30
    2.5 真核细胞的转染  30
    2.6 GST-pull down  30-31
    2.7 免疫印迹  31
    2.8 免疫沉淀  31-32
    2.9 免疫荧光  32
    2.10 核质分离  32
    2.11 线粒体分离  32-33
    2.12 ELISA  33
    2.13 分子筛渗透层析  33-34
    2.14 小鼠 BMDC 的分离  34
    2.15 Caspase-1 活性检测  34-37
结果  37-63
  1. MAVS 与 ASC 相互作用  37-41
    1.1 MAVS 与 ASC 在体内外相互作用  37-39
    1.2 MAVS 与 ASC 相互作用的结构域  39-41
  2. MAVS 增强 ASC 的蛋白稳定性及其介导的 IL-1 水平  41-45
    2.1 MAVS 增强 ASC 介导的 IL-1 水平  41-42
    2.2 MAVS 增强 ASC 的蛋白稳定性  42-45
  3. MAVS 通过 TRAF3 调控 ASC  45-51
    3.1 TRAF3 增强 ASC 介导的 IL-1 水平  45-46
    3.2 TRAF3 催化 ASC 发生泛素化  46-47
    3.3 TRAF3 与 ASC 相互作用  47-48
    3.4 TRAF3 增强 ASC 的蛋白表达水平  48
    3.5 TRAF3 影响 ASC 的半衰期  48-49
    3.6 MAVS 对 ASC 的调控依赖于 TRAF3  49-51
  4. TRAF3 催化 ASC K174 位发生 K63-连接的泛素化  51-54
    4.1 TRAF3 催化 ASC 发生 K63-连接的泛素化  51-52
    4.2 TRAF3 催化 ASC K174 位发生泛素化  52-54
  5. 病毒感染后 TRAF3 对 ASC 的泛素化介导其核质穿梭  54-59
    5.1 病毒感染后 ASC 发生泛素化  54-55
    5.2 MAVS 与 TRAF3 参与病毒感染后 ASC 的泛素化过程  55-56
    5.3 病毒感染后 TRAF3 促进 ASC 由细胞核向细胞质转移  56-58
    5.4 病毒感染后 ASC(K174R)无明显核质穿梭  58-59
  6. 病毒感染后 MAVS 与 TRAF3 促进炎症小体激活  59-63
    6.1 病毒感染后 MAVS 与 TRAF3 促进 pro-caspase-1 切割和 IL-1β 产生  59-61
    6.2 病毒感染后 TRAF3 与 ASC 形成大分子复合物  61-63
讨论  63-69
  1. MAVS 与 ASC 形成复合物  63-64
  2. MAVS 增强 ASC 的蛋白稳定性及其介导的 IL-1 水平  64-65
  3. MAVS 通过 TRAF3 对 ASC 的泛素化调控炎症小体信号通路  65-66
  4. MAVS 与 TRAF3 参与病毒感染后炎症小体的激活  66-69
结论  69-71
参考文献  71-81
文献综述  81-89
  参考文献  84-89
个人简历  89-91
发表文章  91-92
附录  92-99
致谢  99

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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