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耐药基因及病原体高通量检测芯片的研制及初步应用

作　者: 傅雅丽
导　师: 李越希; 潘英
学　校: 南京医科大学
专　业: 流行病与卫生统计学
关键词: 基因芯片耐药基因病原体优化初步应用
分类号: R34
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

病原体引起的感染性疾病严重威胁人类健康。随着生物技术的进步，抗生素大量不合理使用，导致多重耐药菌的产生，近年更出现了超级细菌，导致临床治疗难度大，也构成了严重的公共卫生问题。且随着环境污染日趋严重，一些从前未出现过的疾病又给人类带来了新一轮的威胁。传统病原体检测方法存在耗时长、受培养条件限制、只对少量样品检测等缺点，越来越不能满足临床的需要。因此，发展快速、准确、检测病原体的方法一直是人们追求的目标。基因芯片技术（Genechip）是90年代中期以来快速发展起来的分子生物学高新技术，因其高通量、大规模、并行化处理的特点，为病原体的分子诊断提供了有力的技术条件。它可以实现对多种目标基因的平行高通量鉴定，能够很好地对多种感染性疾病的病原体，耐药性及毒素因子进行检测，提高病原体的检出水平，这正是有效预防感染性疾病发生和控制其迅速传播的前提和关键。本文的研究目的是建立针对多种耐药基因及病原体检测的高通量基因芯片，为快速确定细菌耐药性、指导临床合理选用抗菌药及快速筛查病原菌提供依据。根据NCBI数据库中提供的各类已发表基因序列，按照探针设计原则，筛选和设计合成有代表性的17大类耐药性基因探针115条（包括超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、四环素家族耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、耐消毒剂基因、红霉素耐药相关基因、大环内酯类外排基因、耐万古霉素耐药基因、多药耐药外排泵基因、耐莫匹罗星基因、磺胺类耐药基因、泰洛星耐药基因、氟喹诺酮类药物耐药基因，金葡菌金标准mecA基因和常用基因工程耐药基因），8类病原体种类特异基因探针32条（包括鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、鼠疫耶尔森菌、炭疽芽孢杆菌、土拉弗朗西斯菌、志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌、霍乱弧菌）及7类毒素基因探针25条（包括白喉毒素、志贺毒素、肉毒毒素、篦麻毒素、破伤风毒素、葡萄球菌肠毒素和霍乱毒素）共172条探针，分别建立了耐药基因芯片和耐药基因及病原体检测芯片。探讨核酸提取方法，优化全基因组DNA的扩增标记体系，并探讨了探针浓度、点样温度及湿度、杂交液成分及浓度、杂交温度及时间对基因芯片杂交结果的影响，筛选出了基因芯片杂交的最适条件。在此基础上，评价其灵敏度、特异性和重复性等性能指标，并将其运用于临床病原菌及耐药细菌的初步检测中。本实验以抗卡那霉素重组耐药菌株（E.coliDH5α/pET28）为例，确定了合适的基因组DNA提取方法为CTAB/NaCl法。最适点样条件为温度25℃，湿度55%；最适杂交条件为：杂交温度为42℃，杂交时间为4h，杂交液成分为50%去离子甲酰胺，5×SSC，0.1%SDS，0.5μg/μL鲑鱼精DNA。基因芯片的检测灵敏度为20ng/μL的DNA。建立的耐药芯片检测常用的基因工程受体菌、基因工程耐药菌、7株已测序参考菌株均得到正确结果，显示其良好的特异性及准确性。耐药基因及病原体检测芯片初步检测霍乱弧菌，O157：H7标准株，沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌及基因工程耐药菌均得到正确检测结果。对42株临床疑似耐药菌进行检测，其中6株为混合耐药菌，与常规药敏试验法相比一致。本研究建立的耐药基因及病原体高通量检测芯片特异性及灵敏性良好，可快速准确检出细菌的耐药性及病原体种类，大大减轻工作量。该芯片检测方法不仅可用于临床耐药菌株的耐药谱检测，指导抗生素的合理使用，而且可用于新发和突发传染病等公共卫生事件的病原体筛查，对在预防和控制感染性疾病的传播及流行中具有重要意义。

全文目录

缩略语  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
前言  11-15
第一部分耐药基因、病原体种类基因及毒力基因探针的设计  15-32
  材料与方法  15-18
  结果  18-30
  分析与讨论  30-32
第二部分耐药基因及病原体检测基因芯片的构建及检测条件的优化  32-57
  材料与方法  32-40
  结果  40-53
  分析与讨论  53-57
第三部分耐药基因及病原体检测基因芯片的初步应用  57-67
  材料与方法  57-61
  结果  61-65
  分析与讨论  65-67
结论  67-68
参考文献  68-74
文献综述  74-89
  参考文献  83-89
附录  89-90
致谢  90

耐药基因及病原体高通量检测芯片的研制及初步应用

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